פיתוח של מודל עכברוש מבוסס אלפא-synuclein עבור מחלת פרקינסון באמצעות הזרקת stereotactic של וקטור ויראלי הקשורים מוקטורים
28 בפברואר 2016
כתב יד זה מתאר כיצד העברת גנים מקומיים בתיווך וקטור ויראלי מספקת דרך אטרקטיבית לבטא טרנסגנים במערכת העצבים המרכזית. הפרוטוקול מתאר את כל השלבים החיוניים לביצוע הזרקת וקטור ויראלי בחומר השחור של החולדה כדי לפתח מודל בעלי חיים מבוסס וקטור ויראלי למחלת פרקינסון.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לפתח מודל בעלי חיים מבוסס וקטור ויראלי למחלת פרקינסון באמצעות הזרקה סטריאוטקטית במערכת העצבים המרכזית. ניתן להשתמש בשיטה זו לפיתוח מודלים נורמליים של בעלי חיים המאפשרים ניסויים פרה-קליניים בתרופות ויכולים להועיל בחקר המנגנון המולקולרי של מחלת פרקינסון כמו גם הפרעות ניווניות רבות אחרות. היתרון העיקרי של השיטה הזו הוא שהיא יכולה לשמש למיקוד ספציפי של אזורי מוח.
ניתן להשיג ביטוי מוחי גבוה ושניתן להשתמש בו ליצירת מודלים של בעלי חיים בזנים ומינים ספציפיים של בעלי חיים. פותחו מערכות הווקטור הסופיות השונות. הבחירה במערכת הווקטורית תלויה בגודל התעלה שאתה רוצה לבטא, משך ביטוי הגנים, הצלילים שאתה רוצה לכוון אליהם ובעיות בטיחות ביולוגית.
מי שתדגים את ההליך תהיה Annelies Aertgeerts, טכנאית מהמעבדה שלנו. התחל בהרדמה נכונה של נקבת חולדת וויסטאר בת שמונה שבועות על פי פרוטוקולים מאושרים. בדוק כי מישור הרדמה כירורגי הושג על ידי לחיצה על כל כף, ושים לב להיעדר רפלקס הנסיגה.
לאחר מכן, השתמש במשתיל MicroTransponder כדי למקם MicroTransponder על גב החולדה. בדוק שה-MicroTransponder ממוקם כהלכה ושניתן לקבל קריאה. כעת גזרו את השיער על קרקפת החולדה, ומרחו חומר הרדמה מקומי על הקרקפת והאוזניים.
העבירו את החולדה למכסה זרימה למינרית, ובצעו את שאר ההליך בטכניקה אספטית. הנח את החולדה במסגרת הסטריאוטקסית, על ידי אבטחת מוטות האוזניים, ואחריהם מוט הפה והאף. כסו את גוף החולדה בשמיכת נייר כדי למנוע ירידה בטמפרטורת הגוף.
יש למרוח חומר סיכה לעיניים כדי למנוע התייבשות של העיניים. לאחר מכן יש לחטא את הקרקפת על פי נהלים מאושרים. משתמשים כאן באחוז יוד אחד באיזופרופיל 70%.
לאחר ביצוע חתך קטן בקו האמצע של הקרקפת, יש לגרד בעדינות את הקרומים שעל הגולגולת ולשטוף במי מלח. לאחר שאפשרתם לגולגולת להתייבש, וודאו שניתן לראות בבירור ברגמה ולמבדה. כעת, מלאו מזרק מיקרו-הזרקה בנפח 10 מיקרו ליטר, 30 מד 20 מילומטר ב-AAV רקומביננטי והניחו אותו על משאבת המיקרו-הזרקה הממונעת המחוברת למכשיר הסטריאוטקסי.
עבור טרנזקציה ספציפית של הנוירונים הדופמינרגיים של החומר השחור, וקטורי AV רקומביננטיים הם הבחירה הראשונה בגלל הטיטר הגבוה שלהם ויעילותם להתמרת נוירונים דופמינרגיים. בדוק את הזרימה, על ידי שחרור טיפה של AAV. השלך כל AAV ששוחרר בחומר ניקוי רב ערכי.
בדוק ויזואלית שהראש מקובע ישר במסגרת הראש. לאחר מכן בדוק שהגולגולת שטוחה, על ידי הזזת קצה המחט לברגמה ומדידת הגובה בנקודה זו, על ידי הורדת קצה המחט בכיוון הגב-גחון עד למגע בגולגולת. חזור על ההליך בלמבדה.
לאחר החזרת המחט לברגמה, הזז את המחט בכיוון האחורי האחורי והמדיאלי לכיוון הסטריאוטקסי להזרקת מיקרו. רשום את הקואורדינטות. באתר ההזרקה יש למדוד את גובה הגולגולת כמו קודם, ולוודא שהוא אינו שונה מיותר מ-0.3 מ"מ מגובה הברגמה.
לאחר מכן קדחו בזהירות חור של שני מילימטר בגולגולת. לאחר קידוח החור, מדוד את גובה הדורה כדי לקבוע את הייחוס שממנו יש ליישם את הקואורדינטה הגבית-גחונית. חודרים לדורה באמצעות מחט בגודל 26.
ספגו כל דם עם הרקמה הסטרילית, והמשיכו רק לאחר הפסקת כל הדימום. כעת הורד לאט לאט את המחט של מזרק המיקרו-הזרקה הטעון מראש למוח לקואורדינטה הגבית-גחונית. ועצרו לרגע.
לאחר מכן הזרקו שלושה מיקרו-ליטר AAV בקצב של 0.25 מיקרו ליטר לדקה. לאחר ההזרקה, הניחו למחט להישאר במקומה למשך חמש דקות נוספות כדי למנוע זרימה חוזרת לאורך מסלול המחט לפני הסרתה לאט. תפר את הקרקפת באמצעות פוליאסטר קלוע מקודד 3.0 וחטא את העור עם אחוז יוד אחד ו-70% איזופרופיל.
כדי לשחרר את מוט האף והפה, ולאחר מכן את שני מוטות האוזניים, כדי להסיר בעדינות את החיה מהמכשיר הסטריאוטקסי. בשלב זה יש לתת משככי כאבים, ובמידת הצורך חומר היפוך הרדמה. לאחר מכן הניחו את החולדה בכלוב נקי על צלחת חימום המוגדרת ל-38 מעלות צלזיוס, ועקבו מקרוב עד שהיא מתעוררת.
לאחר הניתוח, ניתן לחקור את הקינטיקה של ניוון עצבי בכל החיה באמצעות בדיקות התנהגותיות והדמיית PET ולאחר הקרבה, תוך שימוש בטכניקות אימונוהיסטוכימיות. בדיקת הצילינדר להערכת שימוש ספונטני בגפיים הקדמיות, בוצעה בנקודות זמן שונות לאחר הזרקת מיקרו של AAV רקומביננטי המבטא A53T מוטציה אלפא סינוקלאין לתוך החומר השחור. משלושה שבועות לאחר ההזרקה, הפגיעה המוטורית המשמעותית נצפתה בחולדות שקיבלו את המינון החציוני.
ארבעה שבועות לאחר ההזרקה, נצפתה ירידה של 50% בשימוש ספונטני בכף הקדמית הנגדית. בעוד שבעלי החיים שהוזרקו ל-eGFP לא הראו אסימטריה בשימוש בכף הקדמית. חולדות שקיבלו מינון גבוה יותר של AAV 2/7A53T אלפא סינוקלאין רקומביננטי, הראו פגיעה בולטת יותר בשימוש בכף הרגל הקדמית לאחר 29 ימים לאחר ההזרקה.
כדי להוכיח שהליקוי המוטורי שנצפה היה תלוי בדופמין, ניתנה מנה אחת של L-doba. כאשר בדיקת הצילינדר חזרה על עצמה 45 דקות לאחר הטיפול ב-L-dopa, נצפתה התאוששות מלאה של השימוש בכף הקדמית בבעלי חיים שהוזרקו AAV 2/7A53T אלפא סינוקלאין. כדי לעקוב אחר הקינטיקה של ניוון עצבי דופמינרגי ניגרוסטריאטלי באופן לא פולשני לאורך זמן, בבעלי חיים בודדים, קשירה המועברת דופמין כומתה באמצעות טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים של בעלי חיים קטנים עם F-18FECT כרדיוליגנד.
קשירת DAT פחתה משמעותית בבודימן הזנב המקביל של חולדות רקומביננטיות AAV 2/7A53T אלפא סינוקלאין שהוזרקו לאורך זמן. לאחר 32 יום נצפתה ירידה בקשירת DAT של עד 85%. כבקרה חיובית, הזרקת הרעלן העצבי 6 OHDA ב-SN גרמה לאובדן של 90% מקשירת DAT תוך שבעה ימים.
קטעי מוח מחולדות שהוזרקו עם AAV 2/7A53T אלפא סינוקלאין רקומביננטי לאורך זמן היו צבועים חיסונית עבור טירוזין הידרוקסילאז, סמן של נוירונים דופמינרגיים. נתון זה מדגים את האובדן המתקדם של נוירונים דופמינרגיים במשך תקופה של 29 יום לאחר מיקרו-הזרקה. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 45 דקות.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב להשתמש בהתאמות וקטוריות סופיות באיכות גבוהה. לאחר הליך זה, ניתן לבצע טכניקות אחרות, כמו הדמיית PET לא פולשנית, ניתוח התנהגות וניתוח אימונוהיסטוכימי על מנת לקבוע את רמת הניוון העצבי והנוירופתולוגיה. לאחר צפייה בסרטון זה, אמור להיות לך מושג טוב כיצד לבצע הזרקת וקטור ויראלי לחומר השחור על מנת לפתח מודלים של בעלי חיים מבוססי וקטור ויראלי למחלת פרקינסון.
אל תשכח שעבודה עם וקטורים נגיפיים עלולה להיות מסוכנת, וכי תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון עבודה תחת זרימה למינרית וטיהור פסולת נכון בהתאם להליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
כתב יד זה מתאר שיטה לפיתוח מודל בעלי חיים למחלת הפרקינסון המבוסס על וקטור נגיפי באמצעות הזרקה סטראאוטקטית למערכת העצבים המרכזית. טכניקה זו מאפשרת ביטוי גנים ממוקד באזורי מוח ספציפיים, ובכך מקלה על בדיקות פרה-קליניות של תרופות ועל חקר הפרעות נוירודגנרטיביות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- תרפיה גנטית
- הפרעות נוירודגנרטיביות
רקע
- העברה של גנים באמצעות וקטורים ויראליים היא שיטה יעילה לביטוי גנים במוח.
- גישה זו יכולה ליצור מודלים של בעלי חיים למחקר של מחלות כגון מחלת פרקינסון.
- מיקוד ספציפי של אזורי מוח מגביר את הרלוונטיות של המודלים.
- ניתן להתאים מערכות וקטורים שונות בהתאם לצרכי המחקר.
מטרת המחקר
- פיתוח מודל בעלי חיים מהימן למחלת פרקינסון.
- הקלה על בדיקות פרה-קליניות של טיפולים פוטנציאליים.
- חקירת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס מחלת פרקינסון.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הזרקה סטריאוטקטית של וקטורים ויראליים לתוך ה-substantia nigra.
- בחירת מערכות וקטורים בהתבסס על גודל הגן ומשך הביטוי.
- מיקוד בזנים ובמינים ספציפיים של בעלי חיים לצורך פיתוח מודלים.
- הערכת רמות ביטוי הגנים במוח.
תוצאות עיקריות
- העברה מוצלחת של גנים לאזורי מוח ממוקדים.
- הקמה של מודל חיה פונקציונלי למחלת פרקינסון.
- נצפו רמות גבוהות של ביטוי טרנסגן.
- פוטנציאל למחקרים נוספים על מנגנונים ניורודגנרטיביים.
מסקנות
- השיטה מספקת כלי בעל ערך למחקר של מחלת פרקינסון.
- העברה באמצעות וקטורים ויראליים יכולה להעמיק את ההבנה של ניוון עצבי.
- יישומים עתידיים עשויים לכלול בדיקה של אסטרטגיות טיפוליות חדשות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מאפשר פיתוח של מודל חולדה ממוקד למחלת פרקינסון באמצעות הזרקה סטריאוטקטית של וקטורי AAV רקומביננטיים ל-substantia nigra, ובכך תומך בהסרת סיכונים מכניסטיים של פתולוגיית alpha-synuclein. המודל מקל על הערכה פרה-קלינית של ניוון עצבי דופמינרגי והתערבויות טיפוליות, ומספק ביטחון חיזוי לתיקוף מטרות בתוכניות למחלות ניווניות של מערכת העצבים. על ידי השגת ביטוי טרנסגן ספציפי לאזור ותוצאות מדידות של התנהגות והדמיה, גישה זו עולה בקנה אחד עם תהליכי גילוי מוקדמים המתמקדים בהבהרת מסלולים ובזיהוי מובילים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של ניוון עצבי דופמינרגי המתווך על ידי alpha-synuclein במערכת רלוונטית למחלה.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף תפקודי של מטרות באמצעות ביטוי של טרנסגן באזורים ספציפיים ואפיון התנהגותי.
- ערך ניבוי: מספק מדדי דימות ותנועה כמותיים המתואמים עם אובדן דופמינרגי, ובכך מסייע בסינון פרה-קליני.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: יצירת מערכות ביולוגיות מתוקפות עם פנוטיפים ניורודגנרטיביים מדידים לצורך סריקת תרכובות.
- ערך תפעולי: אספקת תוצרים סטנדרטיים וניתנים לשחזור באמצעות מבחן גליל ודימות PET של קישור DAT לצורך מוכנות הבדיקה.
- יכולת הרחבה: מאפשרת שימוש חוזר בפלטפורמה עבור יעדים ניורודגנרטיביים שונים באמצעות התאמת וקטורים וקואורדינאטות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מדמה אובדן פרוגרסיבי של תאי דופמין בניגרוסטריאטם, המשקף את הפתופיזיולוגיה של מחלת הפרקינסון.
- הפחתת סיכון מכניסטית: מקשר בין ביטוי יתר של alpha-synuclein לבין גירעונות התנהגותיים תלויי-דופמין וניוון עצבי.
- קידום מותאם-סיכון: תומך בהחלטות go/no-go המבוססות על ניוון עצבי תלוי-מינון ותגובה ל-L-dopa.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline) וזרימת עבודה
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה דרך זיהוי מובילים ועד לבדיקות יעילות פרה-קליניות, ובכך היא מאפשרת הערכה איטרטיבית של מנגנונים ניו روندגנרטיביים ושל מועמדים טיפוליים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות לגבי רעילות של alpha-synuclein והבהרת מסלולים בנוירונים דופמינרגיים.
- סריקה: מאפשר פיתוח של בדיקות עם נקודות קצה התנהגותיות וכמותיות של הדמיה עצבית להערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספק כימות של קישור DAT באמצעות PET ואימונוהיסטוכימיה של tyrosine hydroxylase כביומרקרים תרגומיים של ניוון עצבי.
- מחקר תרגומי: מקשר בין מניפולציה מולקולרית לתוצאות תפקודיות, ובכך תומך ברצף פרה-קליני.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר למידול מטרות של ניוון עצבי באמצעות הזרקה ויראלית סטראאוטקטית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה באמצעות שחזור של פנוטיפים מרכזיים של מחלת פרקינסון.
- ערך תפעולי: פרוצדורות כירורגיות ופרוצדורות הזרקה סטנדרטיות מבטיחות הדירות בין אתרים ומחקרים שונים.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מוקדמת יותר מבוססת נתונים לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go), על ידי הפחתת העמימות המכניסטית במעורבות המטרה.
- השפעה על הפורטפוליו: מסייע בתעדוף מותאם סיכון של טיפולים המכוונים ל-alpha-synuclein, בהתבסס על נתוני תגובה למינון והפיכות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוח סטריאוטקטי, טיפול בווקטורים ויראליים והרדמת מכרסמים.
- תלוי בתשתית למיקרוטומיה, אימונוהיסטוכימיה, דימות PET ובדיקות התנהגותיות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של קואורדינטות, טיטרי של וקטורים ומשטרי מינון.
- שיקולי התאמה כוללים בחירת פרומוטור, טרופיזם של סרוטיפ ותכנון טרנס-גן עבור יעדים שונים.
- מגבלות מעשיות כוללות שונות ניתוחית, דיפוזיה של הווקטור מעבר לגרעיני המטרה וקינטיקה של ביטוי התלויה במין.
