CRISPR וקטור בינוי אפיון תפוקה גבוהה של שינויי DNA על ידי דור של שורשי עגבניות שעירים

המטרה הכוללת של הליך שיבוט וטרנספורמציה זה היא ליצור ביעילות וקטורי CRISPR ולדפוק שורשי עגבניות מוטנטיים שניתן להשתמש בהם במחקרים גנומיים פונקציונליים. שיטה זו היא כלי שימושי בתחום הגנומיקה של הצמח מכיוון שהיא יכולה ליצור מספר רב של מוטציות נוקאאוט שניתן להשתמש בהן במגוון תהליכי שורש. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע את הליך השיבוט בצעד אחד, תוך התבססות שניתן להשיג חומרים קבוצתיים תוך שבועות ספורים בלבד.

ראשית, תכננו אוליגוס RNA או gRNA כדי לכלול את חלק ה-GN19 של מוטיבים המטרה המוקפים בחמשת רצפי הנוקלאוטידים הראשוניים ושלושת רצפי הנוקלאוטידים הראשוניים הנדרשים להרכבת DNA. עכל 1 עד 5 מיקרוגרם של פלסמיד קזנין P201N עם אנזים ההגבלה Spe1 ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר טיהור העיכול לפי הוראות היצרן, יש להשעות מחדש ב -15 מיקרוליטר של 10 מילי-מולרי Trs HCL.

כמת את כמות ה-DNA על ידי ספקטרופוטומטריית UV. בצע עיכול שני עם אנזים הגבלה Swa1 ב-25 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. בדוק 100 עד 200 ננוגרם על ג'ל אגרוז אפס נקודת שמונה אחוז כדי לאשר עיכול מלא.

לפלסמיד מעוכל כהלכה תהיה פס יחיד ב -14, 313 זוגות בסיסים. כדי להגביר את ה-medicago truncatula השתמש בשישה מקדמים ופיגומים של DNA מפלסמיד מעבורת ה-gRNA של הדיסקית. השתמש בפריימר Swa1 ו-Mtu6F ו-MTU6R, ופיגום F בפיגום Spe1 R, בפולימראז בנאמנות גבוהה.

דמיין שלושה מיקרוליטר אליקווט של מוצרי PCR על ג'ל אגרוז של אחוז אחד כדי לאשר הגברה. מגבר ה-MTU6 הוא 377 זוגות בסיסים, ומגבר הפיגום הוא 106 זוגות בסיסים. יש לטהר את מוצרי ה-PCR הנותרים בהתאם להוראות היצרן.

כמת על ידי ספקטופוטומטריית UV כמו קודם ואחסן ב-20 מעלות צלזיוס שליליות. לאחר מכן, השעו מחדש את כל הצינור של אוליגוס gRNA ל-100 מיקרומולר במים בדרגת מעבדה. הוסף מיקרוליטר אחד של האוליגו ל -500 מיקרוליטר של מאגר 1xNEB שתי נקודות אחת וערבב היטב.

תכנת מחזור תרמי עם מכסה מחומם להחזיק ב-50 מעלות צלזיוס. שלב 100 ננוגרם של הווקטור הליניארי, 50 ננוגרם של מקדם MtU6, 12 ננוגרם של פיגום ומיקרוליטר אחד של אוליגו gRNA מדולל במים לנפח סופי של חמישה מיקרוליטר. הוסף חמישה מיקרוליטרים של מאסטרמיקס מכלול DNA בנאמנות גבוהה פי 2.

מערבבים היטב ומסובבים. דגרו את התגובה למשך 60 דקות במחזור התרמי של 50 מעלות צלזיוס. לאחר השעה ב-50 מעלות צלזיוס, הניחו את התגובה על קרח ולאחר מכן השתמשו בשני מיקרוליטרים כדי להפוך תאי E.Coli מוכשרים באמצעות טכניקות סטנדרטיות.

צלחת את הטרנספורמציה על LB Agar בתוספת 50 מיליגרם למיליליטר קנמיצין ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. סנן את המושבות באמצעות PCR עם הפריימר StUb3p 218R ו-1Sce1R. לדלל אלקווט של תגובת הרכבת ה-DNA הנותרת במים אחד עד חמש, ולהשתמש במיקרוליטר אחד כבקרה חיובית למסך המושבה.

כלול גם ננוגרם אחד של פלסמיד קאסין P201N מעגלי כבקרה ללא הכנסה. לאחר הגברת PCR באמצעות הפרמטרים הכלולים בחלק הכתוב של הפרוטוקול, דמיין מוצר PCR על ג'ל אגרוז של אחוז אחד. לתוספות נכונות יש רצועות של 725 זוגות בסיסים ולווקטורים ללא תוספות יהיה פס של 310 זוגות בסיסים.

גדל מושבות חיוביות בתרביות נוזליות LB Can50 למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס. למחרת, יש לטהר פלסמידים באמצעות ערכת טיהור פלסמיד על פי הוראות היצרן. לאחר ריצוף הפלסמידים המטוהרים של סנגר עם פריימר StuB3P218R, יישר כרומטוגרמות לרצפי מקדם MtU6, יעד ופיגומים כדי להבטיח שלא הוצגו שגיאות במהלך השיבוט.

בצע תקציר אבחון על ידי עיכול מיקרוגרם אחד של פלסמיד עם EcoR5 ו-Sti1. כאשר מדמיינים אותו על ג'ל אפס נקודה שמונה אגרוז, יש לראות את טפיחות הרצועות הללו. לבסוף, הפוך את הפלסמידים לזן Agrobacterium rhizogenes ARqua1 על ידי הוספת מיקרוליטר אחד של הכנת הפלסמיד ל-50 מיקרוליטר של תאים בעלי יכולת חשמלית ואלקטרופורציה בקובטה של מילמיטר אחד.

מוסיפים כ-500 מיקרוליטר של SOC Media ומנערים בחום של 28 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר מכן צלחת על צלחות LB Can50 וגדל בחום של 28 מעלות צלזיוס למשך יומיים. התחל חלק זה של ההליך על ידי עיקור זרעי עגבניות באקונומיקה ביתית של 20 אחוז למשך 15 דקות עם ערבוב מתמיד.

לאחר מכן העבירו את הזרעים למכסה המנוע הלמינר. הסר את האקונומיקה ושטוף במים סטריליים בדרגת מעבדה שלוש פעמים. צלחת 30 זרעים בקופסת GA7 המכילה חצי MS Media.

מניחים לנבוט כיומיים בחושך. לאחר שהזרעים נבטו, העבירו את קופסאות GA7 לאור יום לפני הטרנספורמציה, פסו תרביות A.rhizogenes על LB מוצק המכיל Can50 וצמחו בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס בן לילה. ביום הטרנספורמציה, עבדו במכסה המנוע הלמינרי כדי להוסיף 25 מיקרוליטר של אצטוסירינגון ל -50 מיליליטר של חצי MS ולשפוך שישה מיליליטר לכל צינור תרבית.

השתמש בקצה כפוף של 200 מיקרוליטר כדי לגרד תאי A.rhizogenes מהצלחת ולהשעות מחדש את ששת המיליליטר של חצי נוזל MS. מערבולת את הצינור כדי להשעות מחדש את התאים לחלוטין. לאחר השעיית תאים מכל וקטור, קח מיליליטר אחד של תאים ומדוד את הצפיפות האופטית באורך גל קבוע של 600 ננומטר.

הוסף שני מיליליטר של נוזל חצי MS לצלחת פטרי עם נייר פילטר סטרילי. מסירים קוטילונים מהשתילים ומניחים על נייר הסינון הלח. לאחר איסוף כל הקוטילונים, חתכו את הסנטימטר המרוחק ביותר מהקוטילונים, וכתוצאה מכך חתיכות קוטילדון עם שני קצוות חתוכים.

הוסף את הצמחים לשעבר לפתרונות A.rhizogenes וערבב. דגירה למשך 20 דקות עם היפוך מדי פעם. במהלך הדגירה של A.rhizogenes, הוסף פיסת נייר סינון לצלחת פטרי עבור כל טרנספורמציה של מבנה.

כמו כן, הגדר חצי חומר מוצק MS ללא אנטיביוטיקה במכסה המנוע הזרימה הלמינרית לייבוש. השתמש במלקחיים סטריליים כדי לגרוף קוטילדון מתמיסת A.rhizogenes ולהניח על נייר סינון יבש. מכסים במכסה צלחת פטרי כדי להבטיח שהרקמות לא יתייבשו תוך כדי המשך השינוי הבא.

לאחר מכן, כתם קוטילדון על נייר הסינון והעביר את הצד האבקסיאלי עד לחצי מדיה MS. עטפו את הצלחות בסרט כירורגי וטפחו בחושך בטמפרטורת החדר למשך יומיים. לאחר גידול משותף, העבירו את הצד האבקסיאלי של הקוטילדון כלפי מעלה לחצי מדיום MS בתוספת תשלום.

עוטפים עם סרט כירורגי. שמור על תרביות תחת נורות פלורסנט בטמפרטורת החדר עם תקופת צילום של 16 שעות. לאחר נקודה אחת חמישה עד שבועיים, השתמש במלקחיים סטריליים ובאזמל כדי לעקור שורשים באורך של לפחות שני סנטימטרים מהקוטילדון ולהעביר לחומצה טיקרסילון/קלבולנט וקנאמיצין בתוספת חצי מדיה של טרשת נפוצה.

מעבירים עשרה עד 15 שורשים לצלחת אחת. סמן את מיקום קצות השורש בעזרת סמן. עוטפים בסרט כירורגי ושומרים בחדר התרבות.

לאחר שבוע אחד נראים שורשי טרנספורמציה צומחים על המדיה הסלקטיבית. קצור תת-דגימה של שורשים שעברו טרנספורמציה למיצוי DNA בשיטת מיצוי ה-DNA המועדפת. ניתן לראות שורשים שעירים יוצאים מקוטילדון 11 יום לאחר השינוי.

השורשים נבחרים על חומצה טיקרסילון/קלבולנט וקנאמיצין בתוספת חצי מדיה של טרשת נפוצה למשך כשבוע. פסים אפורים מציינים את מיקום קצות השורש בזמן הציפוי. זוהי דוגמה לשיבוט וריצוף של מוצרי PCR לקביעת מוטציות DNA עם שני מטרות גנים שונות בארבעה אירועי שורש שעירים שונים.

התיבה האפורה מציינת את רצף המטרה GN20 GG והדלתא מציינת את סוג המוטציה. מספר השיבוטים עם המוטציה המצוינת מוצג מימין. זוהי דוגמה לג'ל פוליאקרילאמיד לקביעת מוטציות DNA.

מחיקות גדולות ורצועות הטרו-דופלקס מצביעות על נוכחות של מוטציות DNA ברצפי המטרה. שישה מתוך 12 אירועים עצמאיים הוגדרו כמוטאנטים כפי שמצוין על ידי סמל הדלתא. WT מציין את פקד הסוג הפראי ו- NT את הפקד ללא תבנית.

לאחר השליטה, ניתן לייצר עשרות עד מאות וקטורי CRISPR בשבוע אחד וניתן להשיג חומרים קבוצתיים טרנדיים תוך שבועות ספורים. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב להסיר ולעכב את הצמיחה של כל שאריות אגרובקטריום. צמיחת יתר של אגרובקטריום תעכב ותהרוג כל חומר שורש.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור וקטורי CRISPR באמצעות הרכבת DNA, וכיצד לבדוק את הווקטורים האלה באמצעות מערכת מודל שורש שעיר ועגבנייה.