הערכה סימולטני של DNA Cardiomyocyte סינתזה ploidy: שיטה Assist כימות Cardiomyocyte רגנרציה מחזור

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לכמת את תחלופת התאים השריריים של הלב (cardiomyocytes) באמצעות סימון נוקליאוסידים לטווח ארוך וציטומטריית זרימה כדי לכמת את גרעיני התאים השריריים החדשים, תוך התחשבנות בפוליפלואידיזציה של הגרעינים. שיטה זו יכולה לשמש למענה על שאלות מפתח בתחום של רגנרציה של תאים שריריים של הלב, והיא יכולה לשמש ככלי סריקה לכמותה של שינויים בדינמיקה של יצירת תאים שריריים של הלב. היתרון המרכזי של פרוטוקול זה הוא שהוא מאפשר כימות רגיש ומדויק של יצירת תאים שריריים של הלב חדשים, ללא קשר למקור התאי, תוך בקרה על פוליפלואידיזציה.

24 שעות לאחר ההזרקה השישית של EdU, הניחו את החיה המטופלת במצב שכיבה על הגב והשתמשו במספריים כירורגיים כדי לבצע חתך בעור מהמרכז של הבטן ועד לסרעת. לאחר מכן, תוך כדי החזקת עצם הסטרנום הרחק מחלל הגוף משני הצדדים, חתכו את הסרעת כדי לחשוף את הלב. לאחר מכן, הרימו מעט את הלב וחתכו את כלי הדם הראשיים של נתיב המוצא כדי להוציא את הלב מחלל בית החזה.

מיד לאחר הקציר, העבירו את הלבבות למבחנות צנטריפוגה אינדיבידואליות בנפח 15 mL המכילות 10 mL של PBS שקולל לארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, העבירו את הדגימות לצלחונות פטרי אינדיבידואליים בקוטר 10 cm והשתמשו בסכין נישב (scalpel) כדי לחתוך כל לב לשני חלקים במישור סגיטלי. לאחר מכן, לחצו בעדינות על חלקי הלב באמצעות פינצטה.

הוציאו את שני חלקי הלב והניחו אותם בתוך צלחת פטרי המכילה 20 mL של PBS טרי. חזרו על הפעולה פעם נוספת עם צלחת פטרי חדשה ו-20 mL של PBS טרי. העבירו את שני חלקי הלב לאותו מבחנה של 1.5 mL למיקרוצנטריפוגה והשתמשו במחט בכילוב 25 כדי ליצור חור קטן במכסה של כל מבחנה, כדי למנוע מהמכסה להיפתח לאחר עיבוד הלב.

לאחר מכן, סמנו כל מבחנה והקפיאו את רקמות הלב במיכל עם חנקן נוזלי. עבור כל לב המיועד לניתוח, דגרו 36 mL של BSA בריכוז אחד אחוז ו-PBS במבחנה עבור אולטרה-צנטריפוגה. השליכו את התמיסה לאחר 30 דקות.

לאחר שהמבחנות התייבשו באוויר, הוסיפו 10 mL של תמיסת מדרג סוכרוז לכל מבחנה. לאחר קיצוץ נפרד של דגימות הלב שהוקפאו בחנקן נוזלי באמצעות סקלפל, העבירו את חלקי הרקמה מכל לב למבחנות קוניות נפרדות של 50 mL המכילות 15 mL של בופר לליזיס תאים. הומוגניזו את הדגימות למשך 15 שניות במהירות של 25,000 rpm באמצעות הומוגניזר עם פרוב בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הוסיפו 15 mL נוספים של בופר ליזיס (lysis buffer) לכל מבחנה והעבירו את הדגימות אחת אחת למכתש דאונס (dounce) בנפח 40 mL עם פסטל בעל מרווח גדול. בצעו 10 תנועות עם הפסטל וסננו את תרחילי התאים דרך מסנן של 100 מיקרון ולאחריו מסנן תאים של 40 מיקרון אל תוך מבחנות צנטריפוגה אינדיבידואליות בנפח 50 mL. לאחר מכן, אספו את משקעי הגרעינים של תאי הלב באמצעות צנטריפוגה והשבילו מחדש את התאים ב-25 mL של תמיסת מדרג סוכרוז (sucrose gradient solution) לכל דגימה.

שכבדו את התאים מעל למדרג הסוכרוז נטול הגרעינים בפסולות העל-צנטריפוגה שהוכנו, וסובבו את השכבות באמצעות רוטור עם זרועות נתינג (swing out tube rotor). לאחר הסבב, השביחו מחדש את משקעי הגרעינים ב-1,300 microliters של תמיסת שימור גרעינים והעבירו את הגרעינים למבחנה למיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 mL המסומנת כ-PCM1. העבירו 300 microliters מכל תרחף ממבחנות ה-PCM1 למבחנה חדשה למיקרו-צנטריפוגה, הוסיפו 700 microliters של תמיסת שימור גרעינים טריים וסמנו אותה כ-ISO control.

לאחר מכן, סמנו את גרעיני ה-PCM1 באמצעות נוגדן anti-PCM1 ואת גרעיני בקרת ה-ISO באמצעות נוגדן בקרת איזוטיפ rapid IGG למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. למחרת, סובבו את הדגימות בצנטריפוגה ושחזרו את המשקעים ב-1 mL של תמיפת אחסון גרעינים טריה לצורך צנטריפוגה שנייה תחת אותם תנאים. לאחר הסבב השני, שחזרו את המשקעים ב-1 mL של תמיפת אחסון גרעינים טריה והדגירו את הגרעינים עם 1 µL של פיגמנט fitzy המשולב עם פgment F(ab'2 מנוגדן goat anti rabbit IGG למשך שעה אחת בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס בחושך.

כדי להעריך את דרגת השילוב של EdU, סובב במצנטריפוגה את תרחיפי הגרעינים המסומנים של PCM1 ושל ביקורת ה-ISO, וששוף את המשקעים פעמיים בשני שלבים עוקבים על ידי ריסוס מחדש של המשקעים ב-1 mL של 1%BSA PBS. לאחר השטיפה השנייה, החלף את העל-משקע ב-100 microliters של מקבע EdU והדגרה את הדגימות למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. בתום הקיבוע, שטוף את הגרעינים פעמיים נוספות ב-1 mL של PBS BSA, ולאחר מכן הדגרה את הדגימות עם 100 microliters של תמיסת חדירות מבוססת ספונין בטמפרטורת החדר.

לאחר 15 דקות, הוסיפו 500 microliters של תערובת סימון EdU שהוכנה טרם השימוש לכל מבחנה, להדגרה של 30 דקות בטמפרטורת החדר. בסיום ההדגרה, סובבו את הדגימות במערכת צנטריפוגציה שלוש פעמים, כאשר בשתי הסבבים השנייה והשלישית שטפו את הגרעינים ב-1 mL של PBS BSA. לבסוף, סמנו את הדגימות באמצעות 400 microliters של תמיסת צביעת DNA.

ניתוח אימונוהיסטולוגי של הלבבות שעברו פולס מדגים נוכחות של קרדיומיוציטים המבטאים PCM1 אשר קלטו EdU. עם זאת, ניתן לפרש באופן שגוי את הנתונים שהתקבלו בשיטות אימונוהיסטולוגיות, שכן סוגי תאים אחרים שקלטו EdU עלולים להיות מזוהים בטעות כקרדיומיוציטים. במחקר של עכברי mdx ועכברי ביקורת, ניתוח הסייטומטריה הזרימה המפורט בפרוטוקול זה מאפשר כימות מהיר של יצירת גרעיני קרדיומיוציטים חדשים, תוך החרגת תאים שקלטו EdU עקב דפוליפלואידציה.

בדומה לנתונים שפורסמו בעבר, בניסוי מייצג זה נצפתה עלייה בשיעורי היווצרות גרעיני קרדיומיוציטים חדשים בלבבות של עכברי mdx בהשוואה לקבוצות ביקורת תואמות גיל. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים טכניקה זו בארבע שעות לאורך יומיים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להשתמש הן בביקורות שליליות עבור EdU והן עבור PCM1, כדי שניתן יהיה לקבוע את השערים (gates) באופן מדויק במהלך האנליזה.

טכניקה זו תואמת גם למספר טכניקות אימונוהיסטולוגיות נוספות המשמשות לשלבים מאוחרים יותר, המאפשרות כימות של שילוב נוקלאוציטים במספר סוגים שונים של תאי לב. טכניקה זו שימשה במחקר קרדיווסקולרי כדי לבחון שינויים ברגנרציה של קרדיומיוציטים במודל mdx של קרדיומיופתיה לא איסכמית. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לך הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לכמת במהירות גרעינים של קרדיומיוציטים חדשים, ולבצע ספירה של פוליפלואידיזציה כדי לסרוק שינויים ברגנרציה ובמחזור התאים של קרדיומיוציטים.