יישום סדרתית של הזכוכית Coverslips להעריך את הדחיסה הנוקשת של עדשות העכבר: ניתוח זנים ואת morphometric
3 במאי 2016
עלייה הקשורה לגיל בנוקשות עדשות העיניים קשורה לפרסביופיה. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה וחסכונית למדידת קשיחות עדשת העכבר. עדשות עכבר, כמו עדשות אנושיות, נעשות נוקשות יותר עם הגיל. שיטה זו מדויקת וניתנת להתאמה לעדשות מבעלי חיים גדולים יותר.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את קשיחות הדחיסה והגיאומטריה של עדשות עכבר בגישה פשוטה וזולה. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום העדשות. כגון כיצד הפרעות גנטיות וניסיוניות שונות משפיעות על התכונות הביומכניות של העדשה.
היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא מדויקת, ניתנת לשחזור ואינה דורשת ציוד יקר או מיוחד. שיטה זו מספקת תובנה לגבי המאפיינים של עדשות עכברים, עם יישום פוטנציאלי לאורגניזמים מודלים גדולים יותר כמו חולדות וארנבות. הדמיה של השיטה היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלבי חיתוך העדשות ויישום הכיסוי ללא הדגמה.
מי שתדגים את ההליך תהיה קתרין צ'נג, פוסט-דוקטורנטית מהמעבדה שלי. התחל את הדיסקציה באמצעות מלקחיים מעוקלים כדי ללחוץ על הרקמה סביב העין של עכבר שעבר המתת חסד ולהוציא את העין מהשקעה. לאחר מכן, הסר את העין והניח אותה בכלי חיתוך המכיל PBS טרי תחת מיקרוסקופ ניתוח.
חתכו את עצב הראייה קרוב ככל האפשר לגלגל העין. והכניסו בעדינות ובזהירות פינצטה עדינה וישרות לגלגל העין דרך החור שבו עצב הראייה יוצא מהחלק האחורי של האיבר. בצע בזהירות חתך במספריים מהחלק האחורי לקצה הקרנית, והקפיד לא לפגוע בעדשה.
המשיכו את החתך לאורך המפגש בין הקרנית לסקלרה, לפחות באמצע גלגל העין. ולחץ בעדינות על הקרנית כדי להסיר את העדשה מהעין דרך הפתח. לאחר מכן, השתמש במלקחיים ישרים עם קצה דק כדי להסיר בזהירות כל פסולת גדולה שעדיין מחוברת לעדשה.
ואשר חזותית שהעדשה נקייה מנזק. לפחות שעתיים לפני תחילת מדידות הנוקשות, השתמש באיזון אנליטי כדי לשקול לפחות 10 פתקי כיסוי מאותה קופסה. קבע את המשקל הממוצע של החלקות הכיסוי.
לאחר מכן, הרטיבו מראש את החלקות הכיסוי ומראה בזווית ישרה ב-PBS בטמפרטורת החדר. בזמן שהחומרים עוברים לחות, מלאו את תא המדידה ב-65 עד 75 מיליליטר PBS. והנח את החדר תחת מיקרוסקופ מנתח המכוון להגדלה של פי 30, עם תאורה מלמטה ומקור אור סיבים אופטיים בצד שמאל וימין.
כאשר החלקות הכיסוי מוכנות, הנח את המראה בזווית הנכונה לתוך החדר במרחק קבוע מהחריץ שישמש להחזקת העדשה. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים מעוקלים, העבירו בזהירות את העדשות המנותחות לתא המדידה. הגדר את ספק הכוח האופטי ל-80% מעוצמת האור המקסימלית, והתאם את תפוקת אספקת החשמל בהתאם לתאורת הסביבה, העדפת המשתמש ואיכות התמונה לפי הצורך.
השג תמונות מלמעלה view של העדשות הפרוקות ישירות מעל החדר. לאחר מכן, צלם תמונה של קצה המראה בפוקוס, ואחריה תמונת מבט מהצד של העדשה הפרוקה דרך המראה מחוץ לשקע. לאחר מכן, הנח עדשה לתוך הדיווט, וודא שהעדשה יושבת בצורה מאובטחת וישרה בתוך הדיוות על הקוטב הקדמי או האחורי שלה.
צלם את העדשה במראה. לאחר מכן, הנח בעדינות את החלקת הכיסוי על העדשה. לאחר שתי דקות, צלם תמונה נוספת מהצד של העדשה הטעונה.
המשך להוסיף פתקי כיסוי, וקבל תמונות צד view שתי דקות לאחר הוספת כל פתק כיסוי, עד להחלת סך של 10 פתקי כיסוי. לאחר מכן, הסר את כל פתקי הכיסוי, המתן שתי דקות אחרונות וקבל תמונות צד של העדשה בתוך ומחוץ לדיווט. ותמונת מבט עליונה של העדשה מחוץ לשקע.
כדי לקבוע את גודל גרעין העדשה, הנח עדשה בצלחת פטרי נקייה מלאה ב-PBS והשתמש במלקחיים עדינים וישרים כדי להסיר בעדינות את העדשה. כדי לנתק את תאי הסיבים בקליפת המוח, גלגל את העדשה בין אצבעות הכפפות. לאחר מכן, שטפו בעדינות את גרעין העדשה ב-PBS והניחו את הגרעין בחזרה לתוך תא המדידה.
רכוש תמונה של גרעין העדשה דרך המראה בזווית הישרה. לבסוף, כדי לנתח את התמונות, השתמש בתוכנת ניתוח התמונה המתאימה כדי למדוד את הקוטר המשווני והצירי של העדשות לפני ואחרי כל שלב טעינה. מדוד גם את הקוטר של כל גרעין עדשה.
בניסוי מייצג זה נמדדו הנוקשות והממדים של עדשות עכבר בנות חודשיים, ארבעה ושמונה חודשים וחושבו הזנים הציריים והמשווניים. המתח הצירי הוא פונקציה לוגריתמית של עומס מופעל עם ירידה מובהקת סטטיסטית, תלוית גיל בזנים הציריים והמשווניים תחת העומס המרבי המופעל, מה שמצביע על כך שעדשת העכבר מתקשה עם הגיל. נתוני התמונה שנאספו במהלך ניסוי זה שימשו גם לקביעת מספר מאפיינים מורפולוגיים אחרים של העדשה.
כצפוי, הקוטר הצירי והמשווני, ונפח העדשה, גדלו עם הגיל. יחס הגובה-רוחב מצביע על כך שלעדשה יש קוטר משווני מעט גדול יותר מקוטר צירי. ופרמטר זה לא השתנה עם הגיל.
הקוטר, הנפח והחלק של גרעין העדשה גדלים עם הגיל, מה שמרמז על כך שגרעין העדשה מתעצב מחדש כדי לגדול בגודלו היחסי ככל שהעדשה מזדקנת. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך 30 עד 45 דקות לכל עדשה, אם מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב למקם את העדשה באופן שווה בתוך החריץ, ולאפשר לעדשה להירגע במתח למשך שתי דקות בין כל החלקת כיסוי נוספת.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעריך את קשיחות הדחיסה והמורפומטריה של עדשות עכבר באמצעות יישום רציף של פתקי כיסוי. טכניקה מדויקת, פשוטה וזולה זו סוללת את הדרך לחוקרי עדשות לחקור את ההשפעות הביומכניות של מוטציות גנטיות בעכברים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתווה שיטה פשוטה וחסכונית למדידת הקשיחות של עדשות עין בעכברים, אשר בדומה לעדשות עין אנושיות, קשיחותן עולה עם הגיל. הטכניקה היא מדויקת וניתן להתאימה לשימוש עם עדשות מבעלי חיים גדולים יותר.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה
- ביומכניקה
רקע
- עליות בנוקשות העדשה הקשורות לגיל נמצאות בקשר עם פרסביופיה.
- הבנת התכונות הביומכניות של עדשת העין חיונית לטיפול בבעיות הקשורות לראייה.
- עדשות של עכברים משמשות כמודל לחקר קשיחות העדשה והשלכותיה.
- ניתן להחיל את השיטה על אורגניזמי מודל גדולים יותר, דבר המגביר את הרלוונטיות שלה.
מטרת המחקר
- להערכת קשיחות הלחיצה והגיאומטריה של עדשות עין בעכברים.
- לבחינת האופן שבו גורמים גנטיים וניסוייים משפיעים על תכונות העדשה.
- לספק שיטה הניתנת לשחזור שאינה דורשת ציוד יקר.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מדידת קשיחות לחיצה של עדשות עכבר.
- הערכת גיאומטריית העדשה.
- יישום של גישה פשוטה וזולה.
- הדגמה ויזואלית של טכניקות לדיסקציה של העדשה ולהחלת זכוכית כיסוי.
תוצאות עיקריות
- השיטה מדגימה דיוק והדירות במדידת קשיחות העדשה.
- התובנות שהתגלו יכולות לסייע במחקרים על תכונות העדשה במינים שונים.
- ההדמיה מסייעת בהבנת טכניקות נתיחה מורכבות.
- יישומים פוטנציאליים עשויים להתרחב למודלים של בעלי חיים גדולים יותר.
מסקנות
- שיטה זו מספקת תובנות בעלות ערך לגבי הביומכניקה של העדשה.
- זהו כלי יעיל מבחינת עלות עבור חוקרים בתחום.
- מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בגישה זו כדי לבחון השפעות גנטיות וניסיוניות על תכונות העדשה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הערכה כמותית של קשיחות הדחיסה של העדשה באמצעות כיסויי זכוכית רצופים מאפשרת אפיון ביו-מכני מדויק במודלים של עכברים מהונדסים גנטית. שיטה הניתנת לשחזור וניתנת להרחבה זו תומכת בתיקוף של מטרות בשלבים מוקדמים ובצמצום סיכונים מכניסטיים למחקר של מחלות עיניים. יעילותה מנקודת מבט כלכלית ויכולת ההסתגלות שלה ממצבות אותה ככלי רב-פעמי עבור תהליכי מו"פ פרה-קליניים המתמקדים בפתולוגיות של העדשה ובשינויים ביו-מכניים הקשורים לגיל.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של השפעות גנטיות וניסוייות על הביומכניקה של העדשה.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי כימות שינויים בקשיחות העדשה התלויים בגיל ובמוטציה.
- מסייע בהפחתת סיכונים מנגנוניים עבור מודלים של מחלות עיניות באמצעות אספקת מדדים ביומכניים ישירים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מכין מערכות עדשה מאוששות ex vivo לצורך סריקת תרכובות או סריקה גנטית בהמשך התהליך.
- מספק פלטי מאמץ ומדדים מורפומטריים כמותיים וסטנדרטיים להבטחת השחזוריות של הבדיקה.
- תומך ביכולת הרחבה (scalability) ובשימוש חוזר בפלטפורמה על פני מודלים שונים של בעלי חיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מותאם לפיתוח סמנים ביולוגיים תרגומיים על ידי מידול שינויים ביו-מכניים תלויי גיל הרלוונטיים לפתולוגיות של עדשת העין האנושית.
- מאפשר רצף מגילוי גנטי לוולידציה פרה-קלינית במחקר עדשת העין.
- מספק ביטחון חיזוי לקידום התערבויות המכוונות לעדשת העין.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני במחקר עיני, ותומכת בבדיקת השערות, תיקוף מטרות ומידול תרגומי.
- ביולוגיה של תגליות: מכמת השפעות ביו-מכניות של מניפולציות גנטיות או ניסיוניות בעדשות עין של עכבר.
- סריקה: מציע מדידות כמותיות ושחזירות של מאמץ ומורפומטריה לצורך פיתוח בדיקות.
- אנליטיקה: מספק פלטי סטטיסטי להשוואה בין קבוצות גיל, גנוטיפים או התערבויות.
- מחקר תרגומי: ממדל התקשחות של העדשה הקשורה לגיל, ובכך מסייע בהתאמת סממנים ביולוגיים למחלות בבני אדם.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתן להתאמה למודלים של בעלי חיים גדולים יותר, בתמיכה בסטנדרטיזציה בין תוכניות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בביומכניקה של העדשה.
- ערך תפעולי: מספק בדיקות ביומכניות סטנדרטיות, ניתנות לשחזור וניתנות להרחבה.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתיקי פיתוח עיניים.
- השפעה על תיק הפיתוח: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים של מטרות גנטיות והתערבויות עבור פתולוגיות של העדשה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדיסקציית עדשה והפעלת עומסי לחיצה מדויקים.
- דורש תשתית בסיסית של דימות ואנליזה לצורך ניתוח מורפומטרי.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים כדי להבטיח הדירות בין מחקרים ומודלים שונים.
- ניתן להתאמה למודלים של בעלי חיים גדולים יותר באמצעות התאמות בפרוטוקול.
- תלוי בטיפול זהיר כדי למנוע נזק לעדשה ולהבטיח את איכות הנתונים.
