Denervation כירורגי עורית: שיטה לבדיקת הדרישה עצבה בעכברי מודל של מחלת עור
26 ביוני 2016
מאמר זה כולל פרוטוקולים מפורטים לתיוג גנטי של עור עכבר, ניתוק עצבים כירורגי, ביופסיית עור והדמיה של אפיתל מסומן על ידי צביעת β-גלקטוזידאז שלמה. ניתן להשתמש בשיטות אלה כדי לבדוק את הדרישה לעצבים במודלים של עכברים בעלי עור רגיל ופתולוגי.
המטרה הכללית של הליך זה היא לבחון את השפעתם של עצבים על עור תקין ועור פתולוגי. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לענות על שאלות מפתח בביולוגיה של עור תקין, כגון האם עצבים עוריים משפיעים על ההומאוסטזיס ועל מחלות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להשוות בין דגימות עור שלמות לדגימות עור ללא עיצוב עצבי (denervated) מאותו בעל חיים.
הדגמה חזותית של טכניקה זו היא קריטית, שכן עלול להיות קושי בזיהוי העצבים ובהסרתם תוך גרימת נזק מינימלי לרקמות הסובבות. ראשית, הרדימו את העכבר ובדקו באמצעות צביטה בבוהן כי הוא הגיע לרמת הסדציה המתאימה. כמו כן, ודאו כי העכבר מפגין נשימה ודופק תקינים.
כעת הניחו את בעל החיים על משטח חימום באזור ניתוח סטרילי. בעזרת מכונת תספורת חשמלית, הסירו בזהירות את הפרווה מהצד הגבי (דורסלי) ממנו תילקח הביופסיה. לאחר מכן, נגבו את האזור הגולח באמצעות Betadyne ומגבונים עם אלכוהול.
ודאו שכל גזירי השיער הוסרו מהאתר. כעת סמנו את גבולות אתר הביופסיה באמצעות טוש שחור. כדי לקבל חתכים אורכיים של זקיקי שיער, הקצה הארוך של הביופסיה צריך להיות מכוון בכיוון קדמי-אחורי (anterior to posterior), במקביל לקו האמצע הגבי (dorsal midline).
באמצעות סכין מנתחים, בצעו כריתה בעובי מלא ללא פגיעה בפסיה השרירית שמתחתיה. הדימום הוא בדרך כלל מינימלי. דגימת הביופסיה צריכה לכלול את האפידרמיס, הדרמיס, השומן התת-עורי ואת ה-panniculus carnosus.
שטחו את דגימת העור שהוצאה על נייר סופג יבש, כאשר צד הדרמיס פונה כלפי מטה. גזרו את עודפי נייר הסופג, ואשמרו את הדגימה ב-TBS קר למשך עד שעה אם יש צורך באיסוף דגימות נוספות. חזרו לעכבר, ותפרו את מקום הביופסיה באמצעות תפרי nylon 60 במרווחים של כ-3 מילימטרים.
לאחר מכן, יש להשגיח על העכבר בכלוב התאוששות עד שיחזור להכרה. יש להשתמש במשככי כאבים בהתאם להנחיות המוסדיות שנקבעו לטיפול בבעלי חיים, ולפעול על פי ההנחיות הללו אם העכבר נראה במצוקה. תוך שבעה עד 10 ימים מהניתוח, יש להסיר את התפרים.
המשיכו בעיבוד הביופסיות לצורך היסטולוגיה או צביעת whole-mount. הרדימו את בעל החיים, גלחו את כל העור הגבי, ונקו את האזור באופן דומה להליך הביופסיה. כעת, בצעו חתך באמצעות סכין מנתחים סטרילית לאורך קו האמצע הגבי, מבסיס הצוואר ועד למרחק של כחצי סנטימטר מעל הזנב.
באמצעות פינצטה קהה סטרילית, הרחיקו בעדינות את העור מהצד השמאלי הרחק מהשוק כדי לחשוף את הרקמה שמתחתיה, החל מכריות השומן של השכמה ליד הצוואר ועד למעלה מהגפה האחורית. כעת זהו את העצב העורי הגבי (dorsal cutaneous nerve) תחת מיקרוסקופ סטריאו. אלו נראים כחוטים לבנים הנעים לכיוון הזנב (caudally) דרך הפציה השקופה של דופן הגו, לפני שהם מבצעים פנייה חדה ונכנסים לרקמה החיבורית הרפויה שמתחת לעור.
בשלב הבא, בעזרת פינצטה עדינה במיוחד, הסר את העצבים אך ורק מהצד השמאלי של החיה, הממוקמים באתרים אנטומיים T3 עד T12, על ידי תלישתם מהנקודה שבה המקטעים שלהם מתכופפים בדופן הגו עד לאתרי כניסתם לעור. כוון את הפינצטה בצורה אנכית ואחז בעצבים כחצי סנטימטר מתחת לאתרי הכיפוף שלהם. לאחר האחיזה, משוך כלפי מעלה כדי לגרום לעצבים להימתח ולהיפרד מהרקמה הסובבת אותם לצורך הסרתם.
הימנעו מפגיעה בכלי דם סמוכים. הקפידו לשמור על הרקמה לחה לאורך כל הפרוצדורה באמצעות הגבלה תקופתית של טיפות תמיסת saline 0.9%.
בשלב הבא, הסירו כל עצב מתוך מקשרית העור החשופה. סיבים אלו מהווים את הענפים הדיסטליים של העצב העורי הגבי, והם נראים כחוטים לבנים ומסועפים הממוקמים באופן ספורדי בתוך הרקמה החיבורית בצד הדרמי של מקשרית העור. כדי להסיר ענפים דקים אלו, מקמו את הפינצטה במקביל בקירוב לפני השטח הדרמי, תפסו את העצב ומשכו אותו כלפי מעלה.
הסר את כל העצבים הגלויים באופן זה. אין לנקב את כלי הדם ואת העור. במהלך שלב זה, חשוב להימנע מקרע של כלי דם סמוכים.
אם מצאתם עצב עם כלי דם סמוך, עקבו אחריו עד לאזור שבו אין כלי דם סמוך והסירו אותו באמצעות תלישה. כעת, שחררו את העור בצד ימין של החתך בקו האמצע הגבי, אך אל תסירו עצבים כלשהם. אזור זה ישמש כביקורת ניתוח דמה (sham) בצד הנגדי.
לבסוף, תפרו את פצע החיתוך של בעל החיים ועקבו אחריו לאחר הניתוח כפי שנעשה קודם לכן. מאוחר יותר, כדי לאשר את האובדן היציב של העצבים, שבועות לאחר הניתוח, דקרו בעדינות את האזור שעבר דנרבציה (denervation) באמצעות מחט תת-עורית סטרילית. שימו לב אם בעל החיים מגיב, בדרך כלל על ידי רעד או סיבוב ראשו.
אם אזור העור עבר דנרווציה יציבה, בעל החיים יפגין תגובה מועטה או לא יפגין תגובה כלל. בצעו ביופסיות של העור מאזור חסר התגובה ומצד השם (sham) הנגדי כדי לקבל דגימות ניסוייות וביקורת תואמות. מהביופסיות, חשוב לדגום מספר חתכים היסטולוגיים כדי לזהות הבדלים פוטנציאליים בשכיחות או במורפולוגיה של כיפות מגע (touch domes) בין הדגימות של השם לאלה שעברו דנרווציה.
זן עכברי ה-glebe one cree ERT2 מאפשר תכווין של רקומבינציה גנטית המושרה על ידי טמוקסיפן לאזורים בעור המציגים פעילות גבוהה של מסלול hedgehog, כגון אפיתל של כיפות המגע (touch dome epithelia). עכברים אלו הורחבו עם עכברי abolaxi reporter כדי להדמיא את אפיתל כיפות המגע. ה-Nodes חיוניים לשמירה הן על כיפות מגע נורמליות והן על תאי מרקל (Merkel cells) הקשורים אליהן.
הדבר מודגם ניסויית על ידי אובדן הדרגתי של המורפולוגיה התקינה של כיפת המגע (touch dome), וכן אובדן של תאים ששקעו keratin eight בעקבות דנרבציה (denervation). עצבים חיוניים גם לקידום סיגנל של hedgehog בכיפת המגע, כפי שניטור על ידי ביטוי של Glebe one cree ERE2, וצביעת home-mount beta collective sided מעור תקין (sham) ומעור שעבר דנרבציה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו יש לבצע כריתה כירורגית של עצבי העור הגביים (dorsal cutaneous nerves) כדי לבחון אם עצבים אלו מעורבים בתפקוד תקין של העור או אם הם מווסתים מחלה.
ברגע שהטכניקה תשלט, ניתן לבצעה באופן שגרתי ואמין תוך גרימת עקה מינימלית לבעל החיים. לאחר הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות כגון צביעה פלואורסצנטית של חומצות אמינו כדי לאשר האם העצבים הוסרו לחלוטין מהעור, והאם ביטוי הגנים הושפע.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקולים לסימון גנטי של עור עכבר, דה-נרבציה (denervation) כירורגית וביופסיית עור, לצד שיטות להדמיה של אפיתל מסומן באמצעות צביעת β-galactosidase של דגימה שלמה (whole-mount). טכניקות אלה חיוניות לחקר תפקידם של העצבים במצבים תקינים ופתולוגיים של העור.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- דרמטולוגיה
- פתולוגיה
רקע
- הבנת השפעתם של העצבים על הביולוגיה של העור היא קריטית.
- ייתכן שלעצבים העוריים יש תפקיד בהומאוסטזיס של העור ובמחלות.
- ניתוח השוואתי של עור שלם ועור שעבר דנרובציה (הסרת עצבים) עשוי לספק תובנות.
- טכניקות ויזואליות נחוצות בשל הקושי בזיהוי העצבים.
מטרת המחקר
- לבחינת תפקידם של העצבים בביולוגיה רגילה של העור.
- להערכת השפעת העצבים על מצבים פתולוגיים של העור.
- לפיתוח שיטות מהימנות לזיהוי ולהסרה של עצבים.
שיטות שהשתמשו בהן
- סימון גנטי של עור עכבר.
- טכניקות כירורגיות לדנרבציה.
- פרוצדורות לביופסיית עור.
- צביעת β-galactosidase של דגימה שלמה (Whole-mount) לצורך ויזואליזציה.
תוצאות עיקריות
- הדגמת שיטות לזיהוי עצבים בדגימות עור.
- אספקת פרוטוקולים להשוואה בין עור שעבר דנרובציה לעור תקין.
- הדגשת החשיבות של נוכחות עצבים לבריאות העור.
- סיוע למחקרים נוספים על אינטראקציות בין עצבים לעור.
מסקנות
- לעצבים יש השפעה משמעותית על הביולוגיה והפתולוגיה של העור.
- טכניקות שפותחו יכולות לשפר את ההבנה של תפקודי העצבים.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על שיטות אלו כדי להגיע לתובנות עמוקות יותר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת השוואה ישירה בין עור עם עצבים לעור ללא עצבים מאותו בעל חיים, ובכך מספקת גישה מבוקרת להערכת מנגנונים תלויי-עצבים בהומאוסטזיס של העור ובמחלות. על ידי בידוד המשתנה של נוכחות העצבים, היא תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים בתהליך תיקוף המטרות עבור מסלולים דרמטולוגיים. הטכניקה ישימה למודלים של עכברים לפתולוגיה של העור, ומציעה רלוונטיות תרגומית להערכה פרה-קלינית של אינטראקציות נוירו-קוטניות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות בנוגע לאיתות בין העצב לעור באיברים מכנו-סנסוריים עוריים, כגון touch domes.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף תפקודי של מטרות נוירונליות על ידי השוואה בין קבוצות דנרבציה (denervated) לבקרות דמה (sham) תחת רקעים גנטיים זהים.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי הבהרה האם מטרות נוירונליות מניעות פתולוגיה או הומאוסטזיס במודלים של מחלות עור.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- מוכנות הבדיקה: הכנת מערכות ביולוגיות סטנדרטיות עם פלטים כמותיים, כגון מורפולוגיה של כיפת המגע (touch dome) וביטוי גנים, לצורך סריקת תרכובות.
- שחזוריות: יצירת דגימות ניסוי וביקורת תואמות מאותו בעל חיים, דבר המפחית את השונות הבין-סובייקטיבית בתוצאות הבדיקה.
- יכולת הרחבה (Scalability): מאפשר דגימה חוזרת לאורך זמן למעקב אחר התקדמות המחלה, ובכך תומך בתכנון בדיקות אורכיות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: ניתן להתאים למודלים של עכברים לפתולוגיה של העור, כולל דרמטיטיס אטופית, פסוריאזיס וסרטן, כדי לבחון תלות בעצבים.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין ממצאי גילוי לתיקוף פרה-קליני על ידי שמירה על מניפולציה עקבית של העצבים לאורך שלבי המחקר.
- החלטות מותאמות סיכון: מספק מידע לקריטריוני קידום על ידי קביעה האם הפנוטיפים שנצפו דורשים עיצבוב שלם.
אינטגרציה של תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות לגבי מטרה, דרך זיהוי מובילים (leads) ועד לתיקוף פרה-קליני, במיוחד עבור מסלולים נוירו-אימוניים או נוירו-אפיתליאליים בעור.
- ביולוגיה של גילוי: בודק האם עצבים עוריים נחוצים לתחזוקת כיפת המגע (touch dome) או לביטוי גנים, ובכך תומך בהפחתת סיכונים של מסלולים ביולוגיים.
- סריקה: מייצר דגימות עור עם הסרה של העצבים (denervated) ודגימות עור שלמות המתאימות לצביעה סטנדרטית של דגימות שלמות (whole-mount staining) ומדדים מבוססי דימוי.
- אנליטיקה: מאפשר השוואה כמותית של נקודות קצה מבניות ומולקולריות בין תנאים שונים להערכת המשמעות הביולוגית.
- מחקר תרגומי: מיישם אבלציה של עצבים במודלים של מחלות כדי להעריך את ההמשכיות של מנגנונים תלויי-עצבים משלבי הגילוי ועד לשלבים הפרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר למניפולציה של עצבים, שניתן ליישם על מגוון מודלים של מחלות עור ומחלקות של מטרות טיפוליות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי בידוד תרומת העצב לפנוטיפים של העור.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של הליכי הסרת העצבים וביקורת, ובכך משפר את השחזוריות בין מעבדות שונות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של go/no-go על ידי אישור מעורבות המטרה בהקשר רלוונטי פתופיזיולוגית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים של מטרות נוירו-עוריות בהתבסס על דרישה תפקודית במודלים של מחלות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות מיקרו-כירורגיות ובזיהוי עצבים תחת מיקרוסקופ דיסקציה.
- תלוי בתשתית כירורגית סטרילית ובפרוטוקולים לטיפול בבעלי חיים לאחר ניתוח.
- מחייב סטנדרטיזציה של היקף הדנרובציה (denervation) ושל שיטות התיקוף (למשל, בדיקות תחושתיות) בין המשתמשים השונים.
- יש להביא בחשבון שונות בהתרגנרות עצבית או באינרובציה מפצה בעת ניתוח נתונים אורך (longitudinal data).
- מוגבל לאזורי עור גביים נגישים; התאמה לאתרים אחרים עשויה לדרוש גישות כירורגיות שונות.
