סטנסיל micropatterning של תאי גזע האנושי pluripotent עבור גשוש הארגון המרחבי של גורל הבידול

המטרה הכללית של שיטת המיקרו-דפוס (micropatterning) מבוססת השבלונה הזו, עבור תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים, היא לספק אמצעאי פשוט ויציב ליצירת מדרגי סביבה מרחביים השולטים בדפוסי התמיינות של תאי גזע. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בנוגע לדפוסים רקמתיים באמצעות מודל של תאי גזע אנושיים, כגון כיצד מדרגים מרחביים בכוחות היצמדות בין תאים ובין תא למטריקס יכולים לסייע בארגון גורלות ההתמיינות של תאי גזע. היתרון של שיטה זו הוא שהיא אינה דורשת שינוי פני שטח נוסף כדי ליצור דפוסי ECM דביקים לתאים, שבהם יוכלו התאים להיקלט.

משמעות הדבר היא שהשיטה תואמת לתצורות שונות של ECM ותשתיות, בהתאם לכל סוג תא. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן שלבי המיקרו-דפוס (micropatterning) קשים ללמידה, מכיוון שהם דורשים טיפול מדויק וזהיר בשבלונה ובתאים.

עבור הליך זה, שבלונות ה-PTMS חייבות להיות מעוצבות ומיוצרות מראש. באופן דומה, יש לגדל תאי EFC אנושיים על מטריצת קרום בסיס, כך שהמושבות יהיו מוכנות לזריעה בהמשך ההליך. כדי להתחיל, מלאו צלחת ב-700 µL של אתנול 70% בדרגת ניקיון אנליטית, במים אולטרה-טהורים.

לאחר מכן, הניחו את שבלונת ה-PDMS על התמיסה, והכניסו את הצלחת למCבט בטיחות ביולוגית לייבוש למשך הלילה. למחרת, ודאו שלא נוצרו בועות מתחת לשבלונה. לאחר מכן, השאירו את הצלחת בהמתנה עד שניתן יהיה לזרע את התאים על השבלונה.

הכינו מנה של מטריקס קרומי בסיס באיכות ESC אנושית על ידי הוספת 16.7 milliliters של DMF12, כדי להכין תמיסה בריכוז 1.5x, ושמרו אותה על קרח. התניחו את התשתית לטיפול בפלזמה של חמצן בהספק של 100 watts למשך 90 שניות. אין לפתוח את הצלחון עד להכנסתו לתא הפלזמה, וכסו אותו במהירות לאחר הטיפול.

טיפול זה ימנע היווצרות בועות בעת טבילת התשתית בתמיסה. כעת, כסה את השבלונה ב-450 µL של תמיסת basement membrane matrix 1.5x שהוכנה. לאחר מכן, אטום את הצלחת באמצעות parafilm והדגרה אותה למשך חמש שעות.

לפני ההמשך, יש לבחון את פלטות שש הבארות של מושבות HESC שהוכנו. זהו ושאב החוצה מושבות של תאים מובחנים שאיבדו את המורפולוגיה הטיפוסית של HESC. כולן צריכות להיראות עגולות, בעלות מורפולוגיה אפיתליאלית דחוסה, ויחס גבוה של גרעין לציטופלזמה עם גרעינונים בולטים.

לאחר מכן, שטפו כל באר של תאים שהוצמדו עם שני מיליליטר של DMF12 פעמיים. לאחר השטיפה השנייה, הוסיפו מיליליטר אחד של אנזימים מעכלים לכל באר, כגון accutase, והדגירו את הפלטה למשך שמונה דקות ב-37 °C. לאחר הדגירה, הקישו בעדינות על הפלטה כדי לנתק את כל המושבות מהמצע.

בשלב הבא, שטפו כל באר בלפחות ארבעה מיליליטר של מצע עבור כל מיליליטר של אנזים עיכול שהוסף לבאר, ואספו את תליית התאים לשפופרת קונית אחת של 15 מיליליטר. סבבו את התאים בצנטריפוגה ב-200 g למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר כדי להוות משקע תאים. לאחר מכן, שאבו את הנוזל העליון (supernatant), ותלו שוב את התאים ב-400 microliters של מצע תחזוקה ל-HESC, המועשר ב-10 micromolar של מעכב ROCK.

יש לבצע טריטורציה (Trituration) עדינה של התאים שלוש פעמים כדי לפרק את הגושים. לאחר מכן, יש לתקן את צפיפות הסוספנסיות. ערבבו היטב, והכינו דילול של 1:20 בנפח של 200 microliter במצע גידול.

ספרו את התאים בדילול באמצעות המוציטומטר. לאחר מכן, דללו את תרחיף המקור לפי הצורך, תוך שימוש במדדי גידול עם מעכב ROCK. להמשך התהליך, הוסיפו את מספר התאים הנדרש לכל שבלונה שהוכן.

יש להשקיע רק שכבה אחת של תאים, לכן יש לפרוס אותם באופן אחיד. השאירו את השבלונה ללא הפרעה למשך חמש דקות, כדי שהתאים יוכלו לשקוע. לאחר מכן, העבירו בזהירות את השבלונות הטעונים לאינקובטור, תוך שמירה על פלטות שטוחות לאורך כל ההעברה.

אפשרו לתאים להיקשר לשבלונות במהלך דגירה של שעה. לאחר שהתאים נקשרו, בחנו אותם תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שהתהליך בוצע כה properly. העבירו את השבלונה בחזרה למC-hood, ושאבו את התאים שלא נקשרו מהשבלונה.

לאחר מכן, הוסיפו שני מיליליטר של 0.5% compatible non-ionic surfactant ב-DMF12 לאזור שסביב השבלונה. סובבו את התמיסה כדי לכסות את השבלונה. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה שעברה אוטוקלב כדי לקלף בעדינות את השבלונה מהצלחת.

לאחר הסרת השבלונה, יש לבדוק את התאים בעלי התבניות המיקרוסקופיות תחת מיקרוסקופ. הגלשן (surfactant) הבלתי-יוני מונע מתאים אלה להתייבש. יש להדגיר את התאים בעלי התבניות המיקרוסקופיות בתמיסת מצע המעשירה בגלשן למשך 10 דקות ב-37 degrees Celsius.

לאחר 10 דקות, שאבו את התמיסה החוצה, ושטפו את הפלטה עם שני מיליליטר של מצע DMF12 רגיל, שלוש פעמים. לאחר השטיפות, הוסיפו שני מיליליטר של מצע תחזוקה ל-HESC עם מעכב ROCK. בצעו בדיקה נוספת של התאים כדי לוודא שהמיקרו-תבניות (micropatterns) נוצרו כראוי.

לאחר מכן, דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה. למחרת, שאבו את המצע, שטפו את התאים פעם אחת עם DMF12, ולאחר מכן הוסיפו שני מיליליטר של מצע דיפרנציאציה מועשר, כדי להשרות את התאים לעבור דיפרנציאציה למזו-אנדודרם. בהמשך, נתחו את התוצאות.

ייצור השבלונה לתאים באמצעות חיתוך בלייזר סיפק מאפיינים בגודל 1000 מיקרון. השבלונה הייתה מורכבת מדף שבלונה דק עם חורים בעלי תבנית מיקרוסקופית, ואטם PDMS ששימש להחזקת התאים. באמצעות כלי זה, נחקרו תאי HESCs בעלי תבנית מיקרוסקופית במהלך התמיינות למסו-אנדודרם.

בפריפריה של מושבות H9-HESC ישנן היצמדויות אינטגרין גבוהות יותר מאשר בתאי פנים המושבה. לפיכවින්, התאים מבדילים לתאי מזו-אנדודרם Brachiary T-positive, כאשר הם מונחים באמצעות activan, BMP4 ו-FGF2. כאשר תאים אלו סודרו בשכבות חד-שכבתיות (monolayers) בעלות גיאומטריות שונות, זוויות ישור זקית וקימורים קמורים הובילו לריכוז מקומי של כוחות מתיחה המתווים על ידי אינטגרין, והביאו להגברת הבידול למזו-אנדודרם.

עוצמת הביטוי של T במיקומים שונים בתוך מושבה בודדת הראתה כי מידת השראת המזו-אנדודרם הייתה אכן גבוהה יותר בפינות חדות של מושבות ריבועיות ומלבניות, ובקימור הקמור של קשת חצי-מעגלית. הדבר מוכיח כי ניתן לווסת כוחות מכניים המתווכים על ידי היצמדות תאים באמצעות השיטה המתוארת. לפני ביצוע הפרוצדורה, חשוב לבצע אופטימיזציה לזמן ציפוי המטריקס, ולזמן עיכול והיצמדות התאים, עבור השורה הספציפית של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שבהם אתם עובדים.