כינון צירי mitotic הבסיסי בטיפות אמולסיה שסתומים
13 באוגוסט 2016
ההרכבה והמיקום של הציר המיטוטי תלויים בכוחות המשולבים הנוצרים על ידי דינמיקת מיקרו-צינורות, חלבונים מוטוריים ומקשרים צולבים. כאן אנו מציגים את השיטות שפותחו לאחרונה בהן הכליאה הגיאומטרית של טיפות אמולסיה כדוריות משמשת לבנייה מחדש מלמטה למעלה של צירים מיטוטיים בסיסיים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לבנות מחדש מבנים דמויי ציר מיטוטי בתוך הכליאה הגיאומטרית של מים בטיפות תחליב שמן. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הרכבת הציר המיטוטי, כגון כיצד ממוקמים ומורכבים צירים, ומהי התרומה הספציפית של רכיבים בודדים לתהליכים אלה? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו משתמשים בגישה מלמטה למעלה כדי לבנות מחדש מבנים דמויי ציר בתוך הכליאה הגיאומטרית המחקה את צורתו של תא מיטוטי.
ניתן להשתמש בשיטה זו גם כדי לחקור תהליכים אחרים התלויים בכליאת תאים. מערבבים 10 חלקים PDMS pre-polymer עם חלק אחד של חומר ריפוי במסה כוללת של כ -40 גרם. לאחר מכן, מניחים את התערובת בתא ואקום למשך כ-30 דקות כדי להסיר בועות אוויר.
בינתיים עוטפים נייר אלומיניום סביב התבנית ליצירת בעומק סנטימטר בקוטר ארבעה סנטימטרים. כשהוא מוכן, יוצקים כ -3/4 מתערובת ה- PDMS לתבנית. לאחר מכן, החזר את ה-PDMS לתא ואקום למשך 30 דקות נוספות.
לאחר הסרת הגז, רפאו את ה-PDMS למשך שעה ב-100 מעלות צלזיוס. בינתיים, הכינו כמה שקופיות זכוכית לציפוי ספין על ידי אבק באוויר דחוס. לאחר מכן, סובב את תערובת ה-PDMS הנותרת על השקופיות.
רפאו את השקופיות הללו למשך שעה ב-100 מעלות צלזיוס כדי להקשיח את ה-PDMS. לאחר מכן, הסר בעדינות את ה-PDMS באמצעות סכין גילוח, ונקב את החורים הנדרשים מרצועות ה-PDMS כדי ליצור שבבים מיקרופלואידיים. כעת, קורונה מטפלת בשבב המיקרופלואידי ובמגלשת זכוכית מצופה PDMS למשך מספר שניות.
לבסוף, מניחים שבב מיקרופלואידי על כל שקופית זכוכית כשהתעלות פונות כלפי מטה, ואופים את הצ'יפס למשך הלילה בחום של 100 מעלות צלזיוס. ראשית, בעזרת כלי זכוכית שטופים בכלורופורם, הכינו כ-250 מיקרוגרם של שומנים מומסים בכלורופורם. יבש בזהירות את תערובת השומנים בגז אינרטי.
ואז הניחו אותו בתא ואקום למשך שעה. לאחר מכן, ממיסים את השומנים בשמן מינרלי ו-2.5% פעילי שטח ל-0.5 מיליגרם למיליליטר, שהם כ-500 מיקרוליטר. כדי להמיס לחלוטין את השומנים, סוניקציה של התערובת למשך 30 דקות ב-40 קילו-הרץ.
לאחר מכן, סובב את ה-PDMS על כוסות כיסוי בעובי התואם את מטרת המיקרוסקופ. לאחר מכן, סובב את ה-PDMS על שקופיות זכוכית. כעת, רפאו את משקפי הכיסוי המצופים PDMS ושקופיות הזכוכית למשך שעה ב-100 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, צור את תאי הזרימה על ידי מרווח הדוק של פרוסות דקות של סרט איטום מעבדה על שקופיות הזכוכית המצופות PDMS. מקם רצועות של שלושה מילימטר במרחק של כשני מילימטרים זה מזה. לאחר מכן, כסו את תאי הזרימה בהחלקת כיסוי מצופה PDMS, ואטמו את המכלול על ידי המסת הסרט ב-100 מעלות צלזיוס למשך דקה מהירה.
לאחר החימום, לחץ בעדינות על המכסה החליק כלפי מטה ואטום אותו עם Valap. לאחר מכן, הכינו PDMS להדמיה ארוכת טווח. נקב חור בקוטר ארבעה מילימטר בפרוסה בעובי שלושה מילימטרים של PDMS.
לאחר מכן, קורונה מטפלת בפרוסת ה-PDMS ובזכוכית כיסוי מצופה PDMS. לאחר הטיפול, הניחו אותם זה על גבי זה, ואפו את המכלול למשך הלילה בחום של 100 מעלות צלזיוס. עקוב אחר היווצרות טיפות במיקרוסקופ שדה בהיר הפוך.
חבר את שלב שמן השומנים לבקר הלחץ, והגביר את הלחץ עד שיוצאת טיפת שמן מצינור השיא. חבר את צינור השיא כדי להכניס שניים משבב המיקרופלואידיקה. לאחר מכן, מלאו לחלוטין את השבבים המיקרופלואידיים בשלב שמן השומנים מהכניסה השנייה.
לאחר מכן, הציגו את שלב המים המבוסס MRB-80 מהכניסה הראשונה. שלוט בגודל הטיפות על ידי שינוי פאזת שמן השומן ולחצי פאזת המים ליצירת טיפות בקוטר של כ-15 מיקרון. כ-800 מיליבר לשלב שמן השומנים, ו-200 מיליבר לשלב המים, הם נקודת התחלה טובה.
לאחר השגת גודל הטיפות הרצוי, מלאו לחלוטין את תא הזרימה בטיפות. טיפות אלו נוצרות באמצעות נפחים קטנים של שלב המים. המשמעות היא שהמערך המיקרופלואידי צריך לפעול במהירות כדי לא לאבד את כל שלב המים לפני שנוצרו טיפות בגודל הנכון.
לאחר המילוי, סגור בזהירות את קצות תא הזרימה באמצעות Valap. אם הטיפות לא מפסיקות לנוע, אז האיטום לא הושלם, או שאולי הוכנסו בועות אוויר. להדמיה ארוכת טווח, העבירו את הטיפות לכוס PDMS, וכסו בשכבה של תערובת שומנים שמן.
הפשירו את הצנטרוזומים בטמפרטורת החדר, והניחו אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי להבטיח גרעין מיקרו-צינורי תקין. בזמן ההמתנה, הכינו את תערובת הבדיקה על קרח. זה צריך להכיל טובולין, GTP, מערכת נבלות חמצן, מחוללי כוח מולקולרי כגון מקשרים צולבים של מיקרו-צינורות, ATP ומערכת התחדשות ATP.
לאחר הערבוב, סובב את הדגימה ברוטור ה-Airfuge המקורר ב-30 psi למשך שלוש דקות. לאחר מכן, הוסיפו לתערובת את הצנטרוזומים שחוממו מראש. מטב את כמות הצנטרוזומים שנוספו כדי לקבל צנטרוזום אחד או שניים לכל טיפה.
לאחר מכן, השתמשו בתערובת זו כדי לייצר טיפות תחליב כפי שתואר קודם לכן. על מנת לגייס דינאין לשומנים ביוטיניליים בקליפת המוח הטיפתית, כלול GFP-dynein TMR וסטרפטווידין לשלב המים. במיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב, דמיין את צמיחת המיקרו-צינורות לאחר 30 דקות בטמפרטורה של 26 מעלות צלזיוס.
בזמן ההדמיה, ניתן לקדם את צמיחת המיקרו-צינורות על ידי העלאת הטמפרטורה ל-28 או אפילו 30 מעלות צלזיוס. עבור הקרנות Z, קח ערימות עם מרווחים של מיקרון אחד, שאמורות לדרוש כ-20 תמונות לכל טיפה. עבור לחלונית המצלמה הראשית, לחץ על ערוך Z והגדר את Z Step ל-1.0.
לחץ על הבא כדי לאחסן את ההגדרות. לאחר מכן, הגדר את רווח ה-EM הליניארי המקסימלי על ידי לחיצה על הכרטיסייה מצלמה בחלונית הרכישה, והחלקת סרגל ה-EM Gain ל-300. לאחר מכן, הגדר את זמן החשיפה ל-200 אלפיות השנייה באותה כרטיסייה.
לחץ על הקלט כדי לאחסן את ההגדרות. עבור ניסויי הדמיה חיה, בצע הקרנות Z כל שתי דקות למשך שעתיים על ידי הפחתת זמני החשיפה לכ-100 אלפיות השנייה, והגדלת מרווחי Z לשני מיקרון. לניסויי הדמיה חיים, השתמש בכוס PDMS במקום בתא זרימה רגיל לקיבוע מקסימלי של הדגימה.
באמצעות הפרוטוקולים המתוארים, נחקרה היווצרות כוכב בטיפות תחליב מים ושמן המכילות צנטרוזומים. בתחילה, הצנטרוזומים מתפזרים בחופשיות בתוך הנפחים המוגבלים. לאחר כ-20 עד 30 דקות, המיקרו-צינורות הראשונים נראים לעין, ודיפוזיה צנטרוזומית הופכת מוגבלת כאשר מיקרו-צינורות גדלים כנגד קליפת המוח לכל הכיוונים.
כאשר המיקרו-צינורות גדלים יותר ממחצית מקוטר הטיפה, הצנטרוזומים נדחפים לגבולות מנוגדים, כאשר מיקרו-צינורות גדלים לאורך קליפת המוח הטיפתית. ללא סטרפטווידין, דימיין מפוזר בתוך הטיפה. עם זאת, עם סטרפטווידין, תוך כ-10 דקות מהיווצרות הטיפות, דינין מקושר לליפידים הביוטיניים.
כאשר צופים בטובולין פלואורסצנטי בנוכחות דינין קליפת המוח, ברור שהצנטרוזומים ממוקמים במרכז. ואילו בהיעדר דינין, הצנטרוזומים נדחפים לצדדים מנוגדים של הטיפה. זה כנראה נובע מכך שדיניין מקדם קטסטרופות מיקרו-צינוריות וכוחות משיכה בקליפת המוח, מה שמביא לריכוז האסטרים.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להשתמש בטכנולוגיות מיקרופלואידיות כדי ליצור מבנים דמויי ציר בטיפות תחליב כדוריות. לאחר השליטה, ניתן לבצע היווצרות טיפות והדמיה תוך שעתיים-שלוש כאשר הם מבוצעים כראוי. באמצעות הליך זה, ניתן לעטוף גורמי הרכבת ציר אחרים על מנת לחקור את השפעתם על המורפולוגיה והמיקום של הציר.
יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות בעת שימוש בכלורופורם או PDMS.
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה לשחזור מבנים דמויי כישור מיטוטי תחת הגבלה גיאומטרית באמצעות טיפות אמולסיה של מים בשמן. גישה זו שואפת להבהיר את מנגנוני ההרכבה והמיקום של כישורים מיטוטיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביולוגיה של התא
- מדעי המוח
- ביופיזיקה
רקע
- כישורי מיטוזה חיוניים לחלוקת התא.
- הבנת הדינמיקה של כישסורי המיטוזה עשויה לחשוף תובנות לגבי תהליכים תאיים.
- כליאה גיאומטרית מחקה סביבות תאיות.
- בשיטות קודמות חסרו טכניקות רקונסטיתוציה (reconstitution) יעילות.
מטרת המחקר
- פיתוח גישה של "מלמטה למעלה" (bottom-up) לחקר הרכבת כישורי הפסיקה.
- בדיקת התרומות של רכיבים בודדים בדינמיקת כישורי הפסיקה.
- בחינת השפעות ההגבלה (confinement) על תהליכים תאיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תבניות PDMS עבור שבבים מיקרופלואידיים.
- יצירת טיפות ליפידים באמצעות לחצים מבוקרים.
- שילוב של צנטרוזומים ומרכיבי מיקרוטובוליים.
- דימוי חי של צמיחת מיקרוטובולים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
תוצאות עיקריות
- שחזור מוצלח של מבנים דמויי כישוף בטיפות.
- תצפית על דינמיקה של מיקרוטובוליים תחת הגבלה מרחבית.
- תובנות לגבי תפקידן של רכיבים בודדים בהרכבת הכישוף.
- הדגמת התאימות של השיטה לתהליכים תאיים אחרים.
מסקנות
- השיטה מספקת פלטפורמה חדשנית לחקר כישורי מיטוזה.
- כליאת גיאומטרית חיונית לסימולציה של תנאים תאיים.
- מחקרים נוספים יכולים להרחיב את ההבנה של דינמיקת כישורי המיטוזה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שחזור של מבנים דמויי כישוף מיטוטי בתוך טיפות אמולסיה המוגבלות גיאומטרית מאפשר ניתוח מדויק של רכיבים מייצרי כוח הקריטיים לחלוקת תאים. מערכת bottom-up זו מספקת פלטפורמה מבוקרת להפחתת סיכונים מכניסטיים ולתיקוף מטרות בשלבי הגילוי המוקדמים, ובכך תומכת בביטחון חיזוי לגבי פורטפוליו של מטרות תרופתיות בשלד התא. גישה זו מגשרת על הפער בין שחזור in vitro לבין מורכבות תאית הרלוונטית למחלה, ומספקת מידע לקבלת החלטות על קידום מותאם-סיכון.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה כמותית של גורמי הרכבת כישורי כישורי (spindle assembly factors) בודדים תחת תנאים מוגדרים.
- תומך בהפחתת סיכונים מנגנוניים על ידי בידוד השפעותיהם של מנועי מיקרוטובוליים, מחברי צלב (cross-linkers) ועוגנים קורטיקליים.
- מסייע בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי שחזור של כליאה תאית ומאזן כוחות.
- מספק פלטפורמה לבדיקה מבוססת השערות של מווסתי שלד התא.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מבסס מערכות ביולוגיות מוגבלות וניתנות לשחזור לצורכי תהליכי סינון עוקבים.
- מספק פלטים כמותיים על דינמיקת מיקרוטובוליים ומיקום כישורי הפריסה.
- מאפשר סטנדרטיזציה של הבדיקה ויכולת הרחבה (scalability) לצורך הערכת תרכובות המכוונות לרכיבי כישור הפיוזה (spindle).
- תומכת בשימוש חוזר בפלטפורמה למגוון מחקרים של הפרעה לשלד התא.
מחקר טרנסלציונלי ופרה-קליני
- מקבלת בין מדידות מאזן כוחות במערכת in vitro לבין פגמים מיטוטיים הרלוונטיים למחלה.
- מספק רצף מהגילוי המכניסטי ועד לתיקוף של מודלים פרה-קליניים עבור סוכנים המכוונים לצמיות.
- תורם לפיתוח ביומרקרים תרגומיים באמצעות כימות של פנוטיפים של הרכבת כישור.
- מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים על ידי הבהרת הבסיסים המכניסטיים של כשל במיטוזה.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטת הרכבה מחדש זו משתלבת ברצף הגילוי, החל ממחקרי מנגנון מוקדמים, דרך זיהוי מובילים ועד לתיקוף פרה-קליני עבור מטרות של השלד התאי.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי יצירת כוח ומנגנוני הרכבת כישורי הפסיקה.
- סריקה: מספק מערכות מוגבלות המוכנות לבדיקה עם תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור.
- אנליטיקה: מאפשר מדידה של מיקום כישורי הפסיקה, דינמיקה של מיקרוטובוליים ותוצרי מאזן כוחות.
- מחקר תרגומי: מגשר בין ממצאים in vitro לפנוטיפים מיטוטיים רלוונטיים למחלה ואסטרטגיות של סממנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה מודולרית הניתנת להתאמה לגורמי הרכבת כישורי פסיקה והפרעות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתוכניות המכוונות לכישורי הפסיקה (spindle).
- ערך תפעולי: מספק מערכות בדיקה סטנדרטיות, ניתנות להרחבה וניתנות לשחזור למחקר של השלד התאי.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי הבהרת מנגנוני המטרה בשלב מוקדם.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של מטרות מיטוטיות ומטרות של השלד התאי לצורך קידום.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרופלואידיקה, ביוכימיה של השלד התאי ודימוג מתקדם.
- מחייב גישה לתשתיות של מיקרו-פבריקציה, מיקרוסקופיה קונפוקלית ויצירת טיפות בבקרה לחצית.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי יצירת טיפות ודימוג.
- התאמה למערכות מודל אחרות עשויה לדרוש אופטימיזציה של ההגבלה (confinement) וריכוזי הרכיבים.
- מגבלות מעשיות כוללות אילוצי תפוקה (throughput) והצורך בבקרה מדויקת של הסטוכיומטריה של הרכיבים.
שאלות נפוצות בתחום הביו-פרמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:47
Microfluidic Chips
2:37
Microfluidic Setup: Lipid Preparation and Making PDMS Items
4:38
Microfluidic Setup: Emulsion-droplet Formation
6:15
Reconstituting Basic Microtubule Asters
7:27
Imaging
8:48
Results: Microtubule Aster Visualization
10:07
Conclusion
