איתור של טפסים השתנו ציטוזין שימוש אימונוהיסטוכימיה רגיש
16 באוגוסט 2016
כאן אנו מתארים שיטה אימונוכימית רגישה למיפוי ההתפלגות המרחבית של נגזרות חמצון 5mC המבוססת על שימוש בנוגדנים משניים מצומדים לפרוקסידאז והגברת אות טירמיד.
המטרה הכוללת של פרוטוקול אימונוכימי זה היא להעריך את ההתפלגות המרחבית של צורות מותאמות של ציטוזין בהקשרים שונים של רקמות ותאים בהתבסס על שימוש בנוגדנים משניים מצומדים של פרוקסידאז והגברת אות טירמיד. שיטה זו מתגברת על המגבלה של טכניקות אחרות שאינן מספקות מידע מרחבי הדרוש להבנת התפקוד הביולוגי של צורות שונות של ציטוזין. בנוסף, שיטה זו מאפשרת זיהוי משותף של צורות שונות של ציטוזין עם סמני שושלת חלבונים וניתן להשתמש בה כדי לחקור את הלוקליזציה הגרעינית שלהם.
כדי להתחיל בהליך זה, תקן קטעי רקמה מיובשים של עוברי עכברי CD1 ורקמות מוח בוגרות על ידי הנחתם בקור קרח של 4% PFA או 4%FA למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הסר את הקיבוע העודף על ידי שטיפת החלקים ב- PBS למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, יש לחלחל את חלקי הרקמה על ידי הנחתם בצנצנת קופלין מלאה במרכזיה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, הסר את ה- PBX העודף על ידי שטיפת החלקים תוך זמן קצר ב- PBT. כעת, הנח את החלקים החדירים ב-2 N HCl למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר לצורך דעיכת DNA. לאחר מכן, העבירו את החלקים ל-10 מילי-מולרי Tris-HCL למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לנטרל את ה-HCl.
לחלופין, שטפו את החלקים שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד ב-PBS. דגרו את החלקים ב-PBT למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הסר בזהירות את הנוזל מהאזור המקיף את חלקי הרקמות.
בינתיים, שמור על חלקי הרקמה לחים. השתמש בעט מחסום הידרופובי כדי להקיף את החלקים מבלי לגעת בהם. לאחר מכן, דגרו את החלקים ב 100 מיקרוליטר של תמיסת חסימה למשך שעה בטמפרטורת החדר בתא לח.
לאחר מכן, דגרו את חלקי הרקמה ב-100 מיקרוליטר של דילול של 1:5000 של נוגדן ראשוני חד-שבטי נגד 5hmC של עכבר ודילול של 1:1000 של נוגדן ראשוני פוליקלונלי אנטי-5caC של ארנב בתמיסה חוסמת למשך שעה בטמפרטורת החדר. לחלופין, בצע את הדגירה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הסר עודפי נוגדנים על ידי שטיפת החלקים בצנצנת קופלין מלאה ב- PBT שלוש פעמים למשך חמש דקות כל אחת בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, הסר עודף PBT, ובמידת הצורך, הקף את החלקים שוב בעט מחסום הידרופובי מכיוון ש-PBT מכיל חומר ניקוי שעלול להחליש את המחסום ההידרופובי. לאחר מכן, בצע דילול של 1:400 של נוגדן מצומד HRP נגד ארנב עז ודילול של 1:400 של נוגדן מצומד נגד עכבר 555 של חמור בתמיסת חסימה. לאחר מכן דגרו את חלקי הרקמה ב-100 מיקרוליטר מתערובת הנוגדנים המשנית למשך שעה בטמפרטורת החדר בתא לח.
לאחר מכן, שטפו את חלקי הטישו בצנצנת קופלין מלאה ב-PBT שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן העבירו את חלקי הרקמה ל-100 מיקרוליטר טירמיד בדילול של 1:200 במאגר הגברת אות הטירמיד למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. זמן הדגירה היה תמיסת הטירמיד צריכה להיות אופטימיזציה ניסויית עבור כל אצווה בודדת של ערכת הגברת אות טירמיד שבה נצפה קשר ליניארי בין עוצמת האות ומשך הגברת האות המבוססת על טירמיד.
מיד לאחר מכן, הסר עודף תמיסת טירמיד על ידי שטיפת השקופיות שלוש פעמים למשך חמש דקות כל אחת ב-PBT. הסר בזהירות עודף PBT וכסה מיד את החלקים בטיפת מדיום הרכבה. הניחו בעדינות פתק כיסוי על חלקי הרקמה ואטמו את החלקת הכיסוי עם לק.
לאחר מכן שמור את חלקי הרקמה בארבע מעלות צלזיוס למשך מספר שעות לפני בדיקה מיקרוסקופית. כדי לקבוע את התפלגות 5hmC בקטעי רקמת המוח, הזיהוי המשותף של שינוי אפיגנטי זה בוצע עם סמן לנוירונים פוסט-מיטוטיים, NeuN. ניתוח אימונוהיסטוכימי גילה כי בעוד שצביעת 5hmC הבולטת התמקמה עם תאים חיוביים ל-NeuN, לתאי גליה שליליים של NeuN היו רמות נמוכות יותר של 5hmC גנומי.
כדי לקבוע את התפלגות 5caC בתאי גזע עצביים מתמיינים בוצעה צביעה של סמן זה עם סמן גליה, GFAP, על תרביות קבועות של תאי גזע עצביים שלושה ימים לאחר השראת התמיינות גליה. בניגוד לתאי גזע עצביים או אסטרוציטים בוגרים, נצפה אות חזק של 5caC בחלק גדול מהתאים המבטאים GFAP. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשמונה שעות אם היא מבוצעת כראוי.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להכין את כל הריאגנטים והחומרים יחד עם הדגימות שלך. לאחר הליך זה, ניתן לבצע הדמיה קונפוקלית על מנת לענות על שאלות נוספות לגבי הפצה גרעינית של צורות שונות של ציטוזין. זה יכול לתרום לפענוח התפקוד הביולוגי הפוטנציאלי שלהם.
אל תשכח שעבודה עם 2 N Hcl עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון ארון בטיחות ובלאי מגן בעת ביצוע הליך זה.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה אימונוכימית רגישה למיפוי ההתפלגות המרחבית של נגזרות חמצון של 5mC באמצעות נוגדנים שניים המשורשרים לפרוקסידאז והגברה של אות באמצעות טיראמיד. השיטה מאפשרת הערכה של צורות שונויות של ציטוזין בהקשרים רקמתיים ותאיים שונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביוכימיה
- ביולוגיה של התא
רקע
- הבנת ההתפלגות המרחבית של ציטוזין משונה חיונית להבהרת תפקודיו הביולוגיים.
- טכניקות נוכחיות סובלות לעיתים קרובות מחוסר ברזולוציה מרחבית, דבר המגביל את יעילותן.
- שיטה זו מאפשרת זיהוי משותף עם סמני שושלת של חלבונים.
- ניתן ליישמה כדי לחקור לוקליזציה גרעינית של מודיפיקציות בציטוזין.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה למיפוי ההתפלגות של נגזרות חמצון של 5mC.
- אספקת מידע מרחבי הנחוץ להבנת התפקידים הביולוגיים של מודיפיקציות אלו.
- הסלה של חקר ציטוזין מודיפיקציה ברקמות שונות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- קיבוע של חתכי רקמה מעוברים של עכברים וממוחות של עכברים בוגרים.
- חדירות (Permeabilization) ודפורינציה של DNA בחתכי רקמה.
- אינקובציה עם נוגדנים ראשוניים ספציפיים לציטוזין שעבר מודיפיקציה.
- שימוש בהגברת אות באמצעות טיראמיד (tyramide signal amplification) לשיפור הגילוי.
תוצאות עיקריות
- צביעת 5hmC נמצאה במיקום משותף עם נוירונים חיוביים ל-NeuN.
- רמות נמוכות יותר של 5hmC גנומי נמצאו בתאי גליה שליליים ל-NeuN.
- אותות חזקים של 5caC נצפו בתאי גזע עצביים במבדל המבטאים GFAP.
- ניתן להשלים את השיטה תוך כשמונה שעות.
מסקנות
- שיטה אימונוכימית זו מספקת גישה חסונה לחקר מודיפיקציות של ציטוזין.
- היא משפרת את ההבנה של התפקודים הביולוגיים של מודיפיקציות אלו בהקשרים עצביים.
- נקיטת אמצעי בטיחות היא חיונית בעת טיפול בריאגנטים כגון 2 N HCl.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
הבנת ההתפלגות המרחבית של מודיפיקציות של ציטוזין היא קריטית לפענוח הבקרה האפיגנטית במערכות רלוונטיות למחלות. שיטה זו מאפשרת זיהוי משותף עם סמני שושלת תאית, ובכך תומכת בתיקוף המטרה ובהפחתת סיכונים מכניסטיים במחקרים בתחומי הנוירולוגיה והאונקולוגיה. היא מספקת ביטחון חיזוי על ידי קישור מודיפיקציות של DNA לפנוטיפים תאיים במודלים פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בחינת השערות טיפוליות באמצעות מיפוי הלוקליזציה של 5hmC ו-5caC בסוגי תאים ספציפיים.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף של מטרות פונקציונליות באמצעות זיהוי משותף עם סמני NeuN ו-GFAP.
- ערך חיזוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי מתאם בין סימנים אפיגנטיים לבין מצבי התמיינות נוירונליים או גליאליים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: הכנת מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף עבור תהליכי עבודה של סריקה אפיגנטית בהמשך הדרך.
- תוצרים כמותיים: הגברת אות טיראמיד (Tyramide signal amplification) מספקת זיהוי רגיש וניתן לשחזור של מודיפיקציות בריכוזים נמוכים.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: פרוטוקול סטנדרטי המאפשר יכולת הרחבה (scalability) על פני סוגי רקמות ופאנלים של נוגדנים שונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: נחקר ברקמות מוח עובריות ובבוגרים, רלוונטי להפרעות נוירו-התפתחותיות ולמחלות נוירו-דגנרטיביות.
- המשכיות תרגומית: נתוני לוקליזציה גרעינית תומכים בהלימה של ביומרקרים משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני.
- קידום מותאם סיכון: רזולוציה מרחבית מפחיתה עמימות מכניסטית במחקרי מעורבות מטרה (target engagement).
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבחינת השערות לגבי מטרות ועד להערכה פרה-קלינית של סממנים ביולוגיים, ובכך מאפשרת זיקוק איטרטיבי של מטרות אפיגנטיות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות על ידי חשיפת התפלגות ספציפית לסוג התא של נגזרות חמצון של 5mC.
- סריקה: מספק מוכנות לבדיקה באמצעות שלבים סטנדרטיים של קיבוע, פרמיביליזציה והגברה.
- אנליטיקה: מייצר קריאות פלואורסצנציה כמותיות המאפשרות השוואה של רמות מודיפיקציה בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר סימנים אפיגנטיים לסמני זהות תא, ובכך תומך ברציפות פרה-קלינית מונחית-סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: הפרוטוקול ניתן להתאמה לסוגי רקמות שונים ושילובים של נוגדנים, דבר המעודד סטנדרטיזציה בין פרויקטים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי קישור מודיפיקציות של ציטוזין לשושלות תאיות ספציפיות.
- ערך תפעולי: הגברת אות באמצעות טיראמיד (Tyramide signal amplification) מבטיחה סטנדרטיזציה ושחזוריות בין מעבדות שונות.
- ערך אסטרטגי: משפר קבלת החלטות של go/no-go על ידי אספקת הקשר מרחבי לתיקוף של מטרות אפיגנטיות.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות מותאם לסיכון על בסיס פעילות אפיגנטית בתאים הרלוונטיים למחלה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות של אימונוהיסטוכימיה ושחזור אפיטופים.
- תלוי בשלבי הידרוליזה (2 N HCl) המחייבים ציוד בטיחות והדרכה מיוחדים.
- דורש פרוטוקולי חסימה ושטיפה סטנדרטיים כדי למזער את אות הרקע.
- התאמה בין מערכות מודל שונות דורשת תיקוף של ספציפיות הנוגדן ויעילות הפרמיאביליזציה.
- מגבלה מעשית: טיפול ב-HCl עלול להשפיע על שלמות האפיטופ עבור חלק מיעדי החלבון, דבר המחייב אופטימיזציה.
