נוהל מסתגל מעבדת האבולוציה של מיקרואורגניזמים שימוש Chemostat

המטרה הכוללת של הליך זה היא לאפשר למיקרואורגניזם להתפתח בתנאי מעבדה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המיקרוביולוגיה, כגון קשרי תפקוד יותרת הכליה, תגובות לחץ, הנדסה מטבולית וכמובן אבולוציה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בחירה מתמשכת של הצאצא המשוכנע ביותר בתנאי מעבדה ספציפיים.

התחל הליך זה בהכנת ציוד, כמו גם מדיום ראשוני, מדיום מתח בינוני ומדיום מתח גבוה, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. חסנו מושבה בודדת או E.coli מסוג בר במבחנה של 15 מיליליטר המכילה ארבעה מיליליטר של מדיום ראשוני. דגרו את המבחנה בחממה רועדת למשך 12 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-220 סל"ד.

דגרו על צנצנת הכימוסטט המספקת אוורור ותסיסה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שש שעות. לאחר הדגירה, חבר באופן אספטי את קצה צינור הסיליקון מהמשאבות לצנצנת הכימוסטט. העבירו באופן אספטי מיליליטר אחד של תרבית מוקדמת לצנצנת הכימוסטט.

הפעל את משאבת היציאה ואסוף את התרבות בשלב האקספוננציאלי. בדוק את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר של התרבית מצינור היציאה. לאחר מכן, הפעל את משאבת הכניסה.

בדוק את הצפיפות האופטית של התרבית ב-600 ננומטר מצינור היציאה כל 24 שעות. לאחר הפעלת הכימוסטט במשך 96 שעות, שהוא מחזור מלא של 9.6, החלף את המאגר לריכוז הנמוך ביותר של מדיום מתח גבוה. כאשר אתה מחליף את המאגר למדיום מתח גבוה יותר, התאים עלולים להיות בהלם.

אם צפיפות התאים נמוכה מדי, הפסק להזין את מדיום הלחץ הגבוה יותר למשך זמן מה כדי להחזיר את צפיפות התא. אם הצפיפות האופטית נמוכה מ-0.2, עצור את משאבת כניסת ההזנה למשך שש שעות. הפעל מחדש את משאבת הכניסה ובדוק שהצפיפות האופטית היא מעל 0.2.

הגדל בהדרגה את ריכוז גורם הלחץ על ידי שינוי הדרגתי למאגר המכיל ריכוז גבוה יותר של גורם הלחץ. קח דגימות של התרבית המותאמת בכל פעם שהיא מגיעה לאבן דרך של הסתגלות ללחץ ואחסן לניתוח גנומי נוסף. לאחסון דגימה, מערבבים את דגימת התרבית של 0.5 מיליליטר עם 0.5 מיליליטר של תמיסת גליצרול מעוקרת של 80% ומאחסנים אותה בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס.

הכן מדיום צלחת 1.6% המכיל את אותו גורם לחץ באותו ריכוז כמו במדיום. צלחת 0.1 מיליליטר של תרבית היציאה מהכימוסטט ודגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות. לאחר הדגירה, בחר מושבות בודדות מהצלחת באמצעות קיסם סטרילי וחסן אותן במבחנות של 15 מיליליטר המכילות את אותו גורם לחץ ובאותו ריכוז בינוני כמו בכימוסטט.

דגירה במשך שש שעות. העבירו מיליליטר אחד של מרק התרבות לבקבוק ארלנמאייר בנפח 250 מיליליטר המכיל 50 מיליליטר בינוני. קצרו 0.5 מיליליטר ממרק התרבות בכל שעה ומדדו את הצפיפות האופטית ב -600 ננומטר.

השוו את קצב הגידול של הזן המותאם לזה של זן הבר בהינתן גורם הלחץ. זן ה-E.coli מסוג הבר התפתח במצב של לחץ סוקסינט גבוה במשך 270 יום, המקביל לכמעט 930 דורות. בכל פעם שנוסף מתח סוקסינט גבוה יותר, ריכוז הביומסה הורד מיד ולאחר מכן שוחזר.

מוצגת כאן תרשים סכמטי של הכימוסטט עם מוטנט שהוא סובלני כנגד הלחץ הסוקסינט הגבוה. רוב התאים הפראיים נשטפים בתנאי הלחץ והמוטנט גדל יותר. בסופו של דבר, אוכלוסיית הצאצאים המוטנטיים גדלה.

המוטציות השנייה והשלישית נבחרות באופן רציף עבור הכימוסטט ובסופו של דבר שולטות בו. איור זה מראה כי הזן המותאם גדל ללא דיחוי בתנאי לחץ סוקסינט גבוהים, בעוד שזן הבר לא. ניתן ליישם אסטרטגיה דומה לאבולוציה מעבדתית אדפטיבית באמצעות כימוסטט עם וריאציה של גורמי לחץ.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לרכוש ולפתח את המיקרואורגניזם בתנאי מוגדר. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך מספר חודשים. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לא לשטוף תאי כימוסטט על ידי הוספת יותר מדי לחץ בבת אחת ולזכור לבדוק את הצפיפות האופטית מדי יום.

בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטות כמו ניתוח גנום וניתוח טרנסקריפטום על מנת לענות על שאלות נוספות כמו איזו מוטציה תורמת לאבולוציה של סובלנות ללחץ?