הערכה מהירה וספציפית של פעילות Halogenating Peroxidase בדגימות דם ליקוציט מועשר
28 ביולי 2016
פרוטוקול זה מתאר את ההעשרה המהירה של לויקוציטים מדגימות דם קטנות לקביעה ספציפית לאחר מכן של פעילות הפרוקסידאז ההלוגנטית בתוך התאים. ניתן ליישם את השיטה על חומר אנושי ולא אנושי ועשויה לתרום להערכה של סמנים דלקתיים חדשים.
המטרה הכוללת של שיטת דלדול אריתרוציטים זו היא להשיג העשרה מהירה ופשוטה של לויקוקטיה מדגימת דם קטנה. יתרונות רבים של טכניקה זו הם שהיא זולה, אמינה ומהירה. יתר על כן, ניתן ליישם אותו על דגימות דם אנושיות ולא אנושיות.
לפני תחילת הליך הליזיס, התאם את הפיפטה למתן מים לשני מיליליטר, ואת הפיפטה ל-PBS לחמישה מיליליטר. לאחר מכן הניחו צלוחיות מים פתוחות ו- PBS מתחת למכסה המנוע בטמפרטורת החדר. מכיוון שהליזה ההיפוטונית היא תהליך קריטי לזמן, יש להכין הכל מראש.
יתר על כן, תהליך הליזיס צריך להיעשות תמיד באותו אופן, כדי לקבל תוצאות תואמות. לאחר מכן, העבירו 100 מיקרוליטר מכל דגימת דם לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. והוסף שני מיליליטר מים מזוקקים לכל דגימה עם מערבולת בהגדרת המדיום.
הניחו את התאים למשך 60 שניות, ואז הוסיפו חמישה מיליליטר PBS. ולערבב את הדגימות על ידי מערבולת. כעת, אספו את התאים על ידי צנטריפוגה, ושפכו את הסופרנטנטים.
הפוך את הצינורות והקש על הפתחים על מגבת נייר כדי להסיר כמה שיותר נוזלים. לאחר מכן חזור על הליך הליזיס ההיפוטוני כפי שהודגם זה עתה. לאחר השגת גלולה יבשה בפעם השנייה, יש להשעות מחדש כל דגימה ב -500 מיקרוליטר של HBSS, עד לקבלת תמיסה הומוגנית.
ולהעביר את התאים לצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר על קרח. כדי לבדוק את ספציפיות הפרוקסידאז של הדגימות לאחר צביעת אמינו פנול פלואורסצאין, או צביעת APF, הוסף תחילה חמישה מיקרוליטרים של מעכב heme peroxidase, 4-ABAH, לדגימות המתאימות לדגירה של 15 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסף חמישה מיקרוליטרים של תמיסת עבודה APF לכל צינור, ומערבל בעדינות את התאים בהגדרה הבינונית.
דגרו את כל הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של תמיסת עבודה של מי חמצן לכל דגימה, ומערבלו בעדינות את הצינורות. לאחר 60 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, צנטריפוגה של התאים, והסר בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדורים.
לבסוף, השעו מחדש את התאים ב-250 מיקרוליטר של HBSS, ואחסנו את הדגימות בחושך עד לניתוחן, כדי למנוע הלבנת תמונות. כאן, מוצגת דוגמה מייצגת של אוכלוסיות הלויקוציטים לאחר ליזה היפוטונית, וצביעה APF כפי שהודגם זה עתה. על ידי התוויית גודל התא לעומת גרעיניות, ניתן לראות את הדלדול החזק של האריתרוציטים, כאשר אוכלוסיית תאי הדם האדומים והפסולת מהווים רק 22% מהאירועים.
יתר על כן, התפלגות העוצמה של הקרינה שמקורה ב-APF מאפשרת הבחנה ברורה של האריתרוציטים והלימפוציטים השליליים לפרוקסידאז, עם חמצון APF מתון שנצפה, עבור המונוציטים והאאוזינופילים החיוביים לפרוקסידאז, וחמצון פרוקסידאז חזק המוצג על ידי הנויטרופילים. לאחר שליטה, ניתן ליישם טכניקה זו על עד 50 דגימות דם במקביל אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו צביעת נוגדנים כדי לזהות את תת-קבוצות התאים המעניינות.
לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום המחקר בבעלי חיים קטנים לחקור את תפקיד הפעילות ההלוגנטית של MPO ו-EPO במודלים של בעלי חיים למחלות דלקתיות כרוניות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה מהירה ופשוטה להעשרה של לוקוציטים מדגימות דם קטנות, השמימהה גם לחומרים אנושיים וגם לחומרים שאינם אנושיים. הטכניקה היא יעילה כלכלית ואמינה, ומסייעת בהערכה של סממנים דלקתיים חדשים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של התא
רקע
- העשרה של לוקוציטים היא קריטית לחקר תגובות חיסוניות.
- שיטות מסורתיות עשויות להיות גוזלות זמן ומורכבות.
- שיטה זו שואפת לפשט את התהליך.
- ניתן להשתמש בה עבור דגימות דם אנושיות וגם עבור דגימות דם שאינן אנושיות.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול להעשרה מהירה של לוקוציטים.
- הערכת פעילות של הלוגנציה פראוקסידאז בלוקוציטים.
- תרומה לזיהוי של סממנים דלקתיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת פפטים למתן מים ו-PBS.
- שימוש במCב זרימה למינרית לעיבוד דגימות.
- ליזיס היפוטוני לדילול כדוריות דם אדומות.
- ביצוע הליזיס בלוח זמנים קפדני.
תוצאות עיקריות
- העשרה מוצלחת של לוקוציטים מדגימות דם קטנות.
- הערכה אמינה של פעילות פראוקסידאז.
- היתכנות עבור דגימות אנושיות ובעלי חיים כאחד.
- פוטנציאל להערכה של סממנים דלקתיים חדשים.
מסקנות
- השיטה יעילה וחסכונית.
- היא משפרת את חקר התגובות החיסוניות.
- מחקרים עתידיים יוכלו להתבסס על פרוטוקול זה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מאפשר העשרה מהירה וסטנדרטית של לוקוציטים מדגימות דם קטנות, ובכך תומך במאמצי גילוי מוקדמים במחקר של מחלות דלקתיות. באמצעות כימות פעילות הפרוקסידאז ההלוגננית של MPO ו-EPO, הוא מספק מדד מכניסטי לתיקוף מטרות ולצמצום סיכונים של מסלולים ביולוגיים. התאימות של השיטה לציטומטריה זרימה ולצביעה בנוגדנים מקלה על שילובה בתהליכי סריקה ובעבודות תרגומיות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של פעילות פראוקסידאז ספציפית ללוקוציטים כדי לתקף את MPO ו-EPO כמטרות טיפוליות בדלקת כרונית.
- ערך תפעולי: משתמש בנפח דגימה מינימלי (50–100 µL), מה שמאפשר דגימה חוזרת ממודלים של בעלי חיים קטנים למחקרי מעקב ארוכי טווח של מעורבות המטרה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: משלב צביעת APF עם ציטומטריה של זרימה כדי להפיק קריאות כמותיות מבוססות פלואורסצנציה של ייצור HOCl/HOBr לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- ערך תפעולי: מאפשר עיבוד בשטח גבוה (high-throughput) של עד 50 דגימות במקביל, התומך במסעות סריקה ניתנים להרחבה.
מחקר תרגומי ופרה-קלמיני
- ערך מדעי: מקשר את הפעילות של לוקוציט פראוקסידאז לתהליכים דלקתיים הרלוונטיים למחלה, ובכך תומך בהתאמה של סמנים ביולוגיים במודלים פרה-קליניים.
- ערך תפעולי: פועל עם דם של בני אדם ומכרסמים, מה שמאפשר רציפות תרגומית בין מינים שונים באישור יעדים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה נכללת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ראשונית לגבי מטרות ועד לאישור פרה-קליני, ובמיוחד בתוכניות למחקר אימונולוגיה ומחלות דלקתיות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות על ידי כימות פעילות פראוקסידאז ספציפית לאנזים באוכלוסיות מופרדות של לוקוציטים.
- סינון: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור באמצעות פלואורסצנציית APF וציטומטריית זרימה, המאפשרות הערכה של השפעת תרכובות על פעילות הפראוקסידאז.
- אנליטיקה: מייצרת נתוני עוצמת פלואורסצנציה מדידים המאפשרים השוואה של תתי-אוכלוסיות של תאים עם פראוקסידאז חיובי (נויטרופילים, מונוציטים, אאוזינופילים) תחת תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין פעילות פראוקסידאז למנגנונים של מחלות דלקתיות, ותומכת בהמשכיות פרה-קלינית כאשר היא משולבת עם צביעה של סמני שטח התא.
- שימוש חוזר ארגוני: העשרה סטנדרטית של לוקוציטים וזיהוי מבוסס APF מהווים פלטפורמה לשימוש חוזר עבור תוכניות מרובות של יעדים דלקתיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה על ידי בידוד פעילות הפרוקסידאז לשושלות לוקוציטים ספציפיות.
- ערך תפעולי: מציע פרוטוקול מהיר וזול הדורש מינימום ציוד (צנטריפוגה, וורטקס, ציטומטר זרימה).
- ערך אסטרטגי: מקצר את לוחות הזמנים להפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי מתן אפשרות להערכה מהירה וחוזרת של מודולציה של המטרה בדגימות לוקוציטים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעודף מותאם סיכון של מעכבי MPO/EPO באמצעות אספקת נתוני פעילות פונקציונלית מוקדמים מתאים פיזיולוגיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בלוקוציטים, ציטומטריה של זרימה וכימיה של גששים פלואורסצנטיים.
- תלוי בגישה לצנטריפוגות, וורטקסים, מ来看看 לזרימה למינרית ומכשירי ציטומטריה של זרימה עם ערוצי פלואורסצנציה מתאימים.
- דורש סטנדרטיזציה של תמיסות העבודה של APF ומימן פראוקסיד בין מעבדות כדי להשיג תוצאות הדירות.
- התאמה למינים שאינם אנושיים דורשת תיקוף של ביטוי פראוקסידאז ויעילות צביעת APF בתתי-אוכלוסיות של לוקוציטים ביעד.
- מוגבל לזיהוי פעילות פראוקסידאז הלוגנציה; אינו מודד תפקודי לוקוציטים אחרים אלא אם הוא משולב עם בדיקות נוספות.
