חיישן מבוסס-Polyaniline של חומצות גרעין

המטרה הכוללת של הליך זה היא לסנתז פוליאנילין מפוזר במים שיכול לשמש לאיתור חומצות גרעין בצורה נטולת תוויות. טכניקה זו היא שיטה חסכונית לאיתור חומצות גרעין. מעבדות שיאמצו אותו ימצאו אותו קל, חזק ורגיש.

היתרון העיקרי של הטכניקה הוא שהיא נטולת תוויות וניתן להשתמש בה לאיתור ישיר של RNA ו-DNA ללא צורך במניפולציה אנזימטית. לטכניקה זו יש פוטנציאל לטכנולוגיות אבחון חדשות ומכיוון שהיא אינה משתמשת בתווית, ניתן להשתמש בה לעיבוד דגימות מטופלים עם מעט מניפולציה. הדגמה חזותית תעזור להסיר את המסתורין של החיישן.

פלטפורמה זו כוללת מדע וביולוגיה של פולימרים, שנראים אקזוטיים מאוד אך למעשה, קלים במיוחד ליישום. ממיסים אנילין לחלוטין ב 60 מ"ל כלורופורם בבקבוק תחתון עגול של 250 מ"ל. לאחר ערבוב בחום של 600 סל"ד במשך חמש דקות, מצננים לאפס עד חמש מעלות צלזיוס עם קרח.

זה בדרך כלל לוקח 15 עד 20 דקות. לאחר מכן, הוסף נתרן דודצילבנזנסולפונאט לתמיסת האנילין בבקבוק תחתון עגול תוך ערבוב ב-600 סל"ד. ממיסים אמוניום פרסולפט ב -20 מ"ל מים ומוסיפים אותו טיפה במשך 30 דקות כדי למנוע התחממות יתר של התגובה.

בצע את התגובה בטמפרטורה של אפס עד חמש מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. שימו לב לתערובת התגובה שהופכת בתחילה ללבנה-חלבית לאחר 15 דקות, לאחר מכן לחומה כהה לאחר שעתיים, ולבסוף לירוק כהה לאחר 24 שעות. לאחר מכן הניחו לו להגיע לטמפרטורת החדר למשך 24 שעות נוספות.

סנן את תמיסת הנתרן PANI dodecylbenzenesulfonate בעזרת משפך בוכנר. מערבבים את המסנן עם 80 מ"ל כלורופורם ו -120 מ"ל מים במשפך הפרדה. דגרו את התמיסה למשך 24 שעות בטמפרטורת החדר ואז אספו את ה-PANI הירוק הכהה ממשפך ההפרדה, והשאירו נתרן דודצילבנזן סולפונאט ו-APS לא מגיבים בסופרנטנט הימי.

יש לדלל את תמיסת PANI 10 X במי כלורופורם ואז לערבב 200 מיקרוליטר של PANI מדולל עם 6.4 מיקרומול של אוליגונוקלאוטידים של DNA בדיקה על ידי נדנוד עדין במשך 15 דקות בצינור מיקרופוגה. הקרין את תמיסת ה-PANI DNA עם 1200 מיקרו-ג'אול לסנטימטר מרובע של UV בקישור צולב למשך שתי דקות. זה קריטי שהחשיפה ל-UV תוגבל לכמות המצוינת.

חשיפה ממושכת ל-UV פוגעת בשינוי הקרינה ב-PANI, ככל הנראה עקב דליפה צולבת קוולנטית של PANI ו-DNA. מתחמי גלולה על ידי צנטריפוגה ב -17, 000 x גרם למשך שש דקות ושטפו עם מי מלח חוצץ פוספט או PBS. לאחר הכדור בפעם השנייה, השהה מחדש ב-PBS.

הוסף שמונה מיקרוליטרים של 100 מיקרומולר, אוליגונוקלאוטידים משלימים של DNA או חומצות גרעין מטרה ל-200 מיקרוליטר של קומפלקסים של בדיקות PANI. בצע הכלאה על ידי נדנוד תערובת התמיסה למשך 15 דקות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס. לאחר גלולת מתחמי PANI על ידי צנטריפוגה ב -17, 000 x גרם למשך שש דקות, יש לשטוף עם PBS ולהשעות במים.

הוסף PANI מטיפולים שונים למיקרו-פלטת של 96 בארות ומדוד פלואורסצנטיות פליטה בטווח של 270 עד 850 ננומטר על ידי עירור ב-250 ננומטר. יש לראות שיא פליטה עבור PANI בסביבות 500 ננומטר. כדי לבצע מדידת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של הדופלקס ההיברדי, יש להניח את PANI על כיסוי זכוכית בורוסיליקט ולייבש ב-40 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.

הוסף שמונה מיקרוליטר של בדיקה של 100 מיקרומולר על סרט PANI מיובש ואז הקרין אותו באור UV למשך שתי דקות. לאחר הקרינה יש לשטוף את סרט הבדיקה PANI עם PBS ולייבש בחום של 40 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. בצע הכלאה למשך 15 דקות על ידי הוספת חומצות גרעין מטרה.

זו יכולה להיות דגימה ביולוגית או אוליגונוקלאוטיד מטרה מבוקר. לאחר מכן יש להשתמש בשטיפת PBS. השג את התמונות הפלואורסצנטיות בהגדלה של פי 40 עם מסנן מעבר ארוך של 500 ננומטר.

מוצגת כאן האינטראקציה האלקטרוסטטית של בדיקות PANI ו-DNA המשופרות על ידי קרינת UV. הכלאה של חומצת הגרעין המטרה גורמת להיווצרות דופלקס, שינוי אישור מבני, מה שמביא לדיסוציאציה של יעד הגשושית מפני השטח של PANI. איור זה מראה את השינוי בפלואורסצנטיות PANI בהיעדר או נוכחות של בדיקה, הן בתמיסה והן במדיום ציפוי מוצק.

העלייה בקרינה נובעת משטף אלקטרונים מ- DNA טעון שלילי, מה שמגדיל את צפיפות האלקטרונים של הפולימר. עם הכלאה של אוליגונוקלאוטידים משלימים, בדיקות מתנתקות, מה שמוביל לשיקום הקרינה של בזיליקום. לעומת זאת, הכלאה עם אוליגונוקלאוטידים יעד בודדים שאינם תואמים אינה מביאה לשיקום זה של פלואורסצנציה בזיליקום.

החידוש העיקרי בטכניקה זו הוא שהיא משתמשת ב-UV קל לאינטראקציה מדויקת וזה למעשה עוזר לה להבחין בין אינטראקציה לא ספציפית לאינטראקציה קלה. לאחר השליטה, טכניקה זו עשויה להימשך עד שעתיים, לא כולל זמן החושים וזמן הייבוש של הציפויים. בזמן שמנסים את ההליך הזה, חשוב לזכור שה-DNA מתמוסס במים והתה החומצי למעשה משנה את התכונה האלקטרונית של ה-PANI.

לאחר צפייה בסרטון זה, הצופים אמורים להבין היטב כיצד לסנתז פוליאנילין מפוזר במים ולהשתמש בתכונות הפלואורסצנטיות שלו כדי לזהות חומצות גרעין. הם יוכלו לשתק את ה-DNA של הגשושית ולבצע הכלאה כדי לזהות מטרות. בעבודה עם המונומר, חשוב לזכור שסינתזה זו מסוכנת וצריכה להיעשות במכסה מנוע עם ציוד מגן כמו משקפי בטיחות, כפפות ומעילי מעבדה.