לימוד חלבון מערכת בקרת איכות של D. discoideum שימוש הדמית תא חי בקרת טמפרטורה
2 בדצמבר 2016
האמבות החברתיות Dictyostelium discoideum הוקמה לאחרונה כמערכת לחקר קיפול שגוי של חלבונים ופרוטאוסטזיס. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה חדשה מבוססת הדמיה לחקר צבירת חלבונים המושרה על ידי טמפרטורה ותגובת הלחץ התאית ב-D. discoideum.
המטרה הכוללת של טכניקת הדמיה זו היא לצפות בהפרעות תאיות הנגרמות על ידי מתח חום בתאי Dictyostelium discoideum. שיטה זו יכולה לעזור להבין את המנגנונים של תגובת עומס חום ובקרת איכות חלבון באמבה Dictyostelium discoideum. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בקרה הדוקה ומדויקת על הטמפרטורה המופעלת על הדמיית הקובץ של התאים.
כדי להתחיל בהליך, הכן תאי דיקטיוסטליום כמפורט בפרוטוקול הטקסט. יום לפני ההדמיה, פיצלו את התאים למדיום פלואורסצנטי נמוך ל-10,000 תאים למיליליטר. לפני ההדמיה, קצרו את התאים מצלחת הרקמה ב-LFM, ולאחר מכן העבירו מספר מספיק של תאים לכלי זכוכית תחתונים.
הניחו לתאים להתיישב במשך 20 דקות ואז החליפו בזהירות את המדיום המשומש במדיום טרי, כדי להסיר תאים לא מיושבים. תאי תמונה בתנאים לא מלחיצים ב-23 מעלות צלזיוס, רוכשים מינימום של שישה שדות ראייה. רכוש ערימות Z של מקסימום שבעה מיקרומטר בצעדים של 1 עד 0.25 מיקרומטר כדי ללכוד את כל נפח התא.
לאחר מכן רכוש תמונת שדה בהיר התייחסות כדי להעריך את המספר הכולל של התאים. לאחר מכן, התאם את הטמפרטורה של תא הקירור ל -30 מעלות צלזיוס. לאחר שתצוגת הטמפרטורה הגיעה לערך הרצוי, התמקד מחדש באופן ידני בערוץ השדה הבהיר.
בדוק את כל ה-FOVs המוקלטים לפני תחילת ה-Time-lapse, ולאחר מכן התחל זמן-lapse לארבע שעות של מתח חום עם מרווח זמן של חמש עד 10 דקות בין נקודות זמן. בדוק כדי לוודא שהמיקוד נכון במהלך רכישת שתי נקודות הזמן הראשונות. לאחר השלמת מתח החום, הפחיתו את הטמפרטורה בחזרה ל-23 מעלות צלזיוס.
המתן עד שתצוגת הטמפרטורה תתכוונן ותמקד מחדש באופן ידני. לאחר מכן הקלט סרטוני דולג זמן בשלב השחזור למשך שמונה עד 10 שעות במרווחי זמן של 10 עד 20 דקות. בדוק כדי לוודא שהמיקוד נכון במהלך רכישת נקודת הזמן הראשונה.
התחל בפתיחת חבילת עיבוד התמונה המצוידת בתוסף Cell Counter. טען את אוסף תמונות השדה הבהיר על-ידי לחיצה על קובץ ולאחר מכן על פתח. לאחר מכן, פתח את התוסף Cell Counter, טען את אוסף התמונות על ידי לחיצה על Initialize.
בחר את סוג המונים על-ידי לחיצה על התיבה המתאימה. לאחר מכן, ספור את מספר התאים הכולל, שמור את הסמנים על ידי לחיצה על שמור סמנים. לאחר שמירת הסמנים, טען את ההקרנה המקסימלית של ההיפר-סטאק של תמונת הקרינה.
פתח את התוסף Cell Counter וטען את הסמנים על-ידי לחיצה על Load Markers. לאחר מכן, בחר את סוג הסמן עבור מוקדים ציטוזוליים וספור את התאים. הסמנים הקיימים יכולים לשמש כהנחיה למיקום של תאים בודדים.
אחזר את מספר הספירה לפרוסה על ידי לחיצה על תוצאות, ולאחר מכן שמור את הספירה במקום אחר לחישובים נוספים. במחקר זה, התפלגות חלבון הפוליגלוטמין Q103 המתויג GFP נצפתה בתאי דיקטיוסטליום. בתנאי גידול רגילים, Q103-GFP מופץ באופן מפוזר בציטופלזמה.
במהלך עומס חום, סמן Q103-GFP מתלכד כדי לנקב מבנים. עם שחרור מתח וצמיחה בתנאי גידול רגילים, מבנים אלה מתמוססים. החלוקה מחדש של Q103-GFP והיווצרות מוקדים ציטוזוליים המושרים על ידי מתח חום מכומתת באמצעות ניתוח תמונה.
את התוצאות המייצגות של תגובת מתח החום ניתן לראות כאן. מספר התאים עם מוקדי Q103-GFP ציטוזוליים גדל במספרם עם עקת חום מתמשכת. במהלך עומס חום, מערכת בקרת איכות החלבון מוצפת, ולכן לא ניתן לשמור על חלבונים המועדים לצבירה במצב מסיס.
לאחר מתח חום, מספר התאים עם מוקדים ציטוזוליים פוחת, מה שמרמז על כך שהחלבונים המצטברים מתמוססים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנטר הפרעות הנגרמות על ידי מתח חום באמבה Dictyostelium discoideum. במהלך ההדמיה, חשוב לזכור לוודא שהמיקוד מותאם כראוי, אם למיקרוסקופ שלך אין פוקוס אוטומטי של חומרה.
ניתן להשתמש בבקרת הטמפרטורה המוצגת בפרוטוקול זה מעבר לתחום תגובת מתח החום. הדמיה בתנאי גידול רגילים באמצעות בקרת טמפרטורה יכולה להפחית באופן משמעותי את ההשפעות הפוטוטוקסיות.
סקירה כללית
מחקר זה מציג מתודולוגיית דימוג חדשנית לבחינת אגרגציה של חלבונים והשפעות מאמץ תאי המושרות על ידי טמפרטורה באמבה החברתית Dictyostelium discoideum. הטכניקה מאפשרת בקרת טמפרטורה מדויקת, המאפשרת לחוקרים לצפות בהשפעות של מאמץ חום על בקרת האיכות של חלבונים.
מרכיבים מרכזיים במחקר
תחום מדעי
- ביולוגיה של התא
- מדעי המוח
- אגרגציה של חלבונים
רקע
- Dictyostelium discoideum משמש כאורגניזם מודל לחקר תגובות תאיות למעיקה.
- הבנת קיפול שגוי של חלבונים חיונית להשגת תובנות לגבי מחלות שונות.
- מעיקה תרמית עלולה להוביל לאגרגציה של חלבונים, ובכך להשפיע על התפקוד התאי.
- טכניקות דימות חיוניות לצפייה בזמן אמת בתהליכים תאיים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לצפייה בשיבושים תאיים המושרים על ידי עקה תרמית.
- הבהרה של מנגנוני התגובה לעקה תרמית ב-D. discoideum.
- הערכת היעילות של בקרת איכות חלבונים בתנאי עקה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תאי Dictyostelium במצע בעל פלואורסצנציה נמוכה.
- דימוי תחת טמפרטורות מבוקרות (23°C ו-30°C).
- דימוי Time-lapse למעקב אחר תגובות תאיות לאורך מספר שעות.
- ניתוח תמונות לכימות אגרגציה והתאוששות של חלבונים.
תוצאות עיקריות
- חלבון Q103-GFP הראה התפלגות דיפוזית בתנאים רגילים.
- במהלך עקה תרמית, Q103-GFP יצר מבנים נקודתיים המעידים על אגרגציה.
- לאחר העקה, מספר התאים עם אגרגטים פחת, מה שמרמז על התאוששות.
- השיטה הדגימה בהצלחה את הדינמיקה של אגרגציה ופירוק של חלבונים.
מסקנות
- טכניקת הדימיון מספקת תובנות לגבי תגובות למעקה תאי.
- בקרת טמפרטורה היא קריטית לצפייה מדויקת בדינמיקה של חלבונים.
- ניתן להחיל מתודולוגיה זו על תחומים אחרים של מחקר על מעקה תאי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימוי תאים חיים תחת בקרת טמפרטורה ב-Dictyostelium discoideum מאפשר בחינה מדויקת של מנגנוני בקרת איכות של חלבונים תחת עקה, ובכך תומך בתיקוף מטרות בשלב מוקדם עבור נתיבים של אגרגציה של חלבונים. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי במחקרים מכניסטיים הרלוונטיים לניוון עצבי ולפרוטאוסטזיס. יכולתה של השיטה להפחית פוטוטוקסיות ולהכמיס אגרגציה דינמית של חלבונים מספקת תובנות יישומיות למיון פורטפוליו בביולוגיה של גילוי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר תצפית ישירה על דינמיקה של אגרגציה של חלבונים במודל חי המגיב למעמדות (stress).
- תומך בהסרה של סיכונים מכניסטיים על ידי כימות תגובות תאיות למעמדות פרוטאו-טוקסי הנגרם מחום.
- מסייע בתיקוף תפקודי של מטרות לבקרת איכות חלבונים הרלוונטיות להפרעות אגרגציה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק פרוטוקול דימות מתוקף לכימות אירועי אגרגציה והמסה של חלבונים.
- מפחית פוטוטוקסיות, מה שמאפשר עוצמות דימות גבוהות יותר עבור חלבונים בעלי ביטוי נמוך.
- תומך בקריאות כמותיות הניתנות לשחזור, המתאימות לתהליכי סינון (screening) בהמשך הדרך.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- תואם למנגנונים הרלוונטיים למחלה של קיפול שגוי של חלבונים ואגרגציה.
- מאפשר רציפות ממחקרי מנגנון בשלב הגילוי ועד לפיתוח מודלים פרה-קליניים.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון עבור תרופיות המכוונות לצבירה.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
פרוטוקול הדמיה זה משתלב ברצף הגילוי, החל ממחקרי מנגנון מוקדמים ועד לתיקוף פרה-קליני של מטרות לצבירה של חלבונים.
- ביולוגיה של הגילוי: מכמתה אגרגציה של חלבונים המושרית על ידי עקה תרמית, ובכך מבהירה מסלולים של פרוטאוסטזיס.
- סריקה: מספקת מדדי אגרגציה כמותיים וניתנים לשחזור לצורך פיתוח בדיקות.
- אנליטיקה: מספקת ספירה ברמת התא של אירועי אגרגציה ודינמיקת התאוששות.
- מחקר תרגומי: ממדלת תגובות לעקה הרלוונטיות למחלות לצורך התאמה של סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פרוטוקול סטנדרטי וניתן להתאמה למגוון מחקרי בקרת איכות של חלבונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות עבור מסלולי אגרגציה של חלבונים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) באמצעות דימות ואנליזה סטנדרטיים.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) על ידי אספקת נתונים כמותיים ומכניסטיים על פרוטאוסטזיס.
- השפעה על תיק הפרויקטים: תומך בתעדוף מותאם סיכון של תוכניות המכוונות לאגרגציה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדימיון תאים חיים ובניתוח תמונות כמותי.
- מחייב מיקרוסקופיה עם בקרת טמפרטורה ותוכנת ניתוח תואמת.
- מצריך סטנדרטיזציה בין צוותים עבור פרמטרי הדמיון ופירוש הנתונים.
- ניתן להתאמה למודלים אחרים של חלבונים הנוטים לאגרגציה באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- ניידות תאים גבוהה ורגישות לפוטוטוקסיות מחייבות תכנון ניסויי קפדני.
