לימוד תהליכים דינמיים של אובייקטים בגודל ננו בנוזל באמצעות מיקרוסקופי אלקטרוני סריקת הילוכים
5 בפברואר 2017
פרוטוקול זה מתאר את הפעולה של בעל דגימת זרימת נוזל עבור מיקרוסקופיית אלקטרוני הילוכים של AuNPs במים, כפי שמוצג על התצפית של תהליכים דינמיים ננומטריים.
המטרה הכוללת של מיקרוסקופ אלקטרונים שידור סריקת פאזה נוזלית היא לצפות במבנים ותופעות של ננו-חומרים בדגימות ביולוגיות המוטמעות במלואן בשכבה נוזלית בעובי של עד מספר מיקרומטרים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי החומרים כגון התנהגות של ננו-חומרים בנוזל וחקר דגימות ביולוגיות בסביבה הנוזלית הטבעית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת מידע מורפולוגי בקנה מידה ננומטרי על דגימות בנוזל.
בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שטעינת מחזיק הדגימה ורכישת התמונה אינם פשוטים כפי שנעשה לראשונה במיקרוסקופ אלקטרונים. כדי להתחיל בהליך, במנדף זרימה למינרי נקי, יש לנקות שקופית זכוכית מיקרוסקופית קלה עם רקמה נטולת סיבים ואתנול טהור. הניחו את השקופית על טישו בחדר נקי בצלחת פטרי עם מכסה.
כדי לתפעל את שבבי ה-SiN, באמצעות פינצטה מצופה פחמן, תפסו את השבב בחוזקה אך בזהירות בצדדים הארוכים, תוך שמירה על קרום ה-SiN פונה כלפי מעלה בכל עת. באמצעות טכניקה זו, הניחו חמישה שבבים ללא מרווח וחמישה שבבים עם מרווח של 200 ננומטר על מגלשת הזכוכית. סוגרים את צלחת הפטרי ומביאים את השבבים למכסה אדים.
מניחים את השבבים בכוס של אצטון בדרגת HPLC כשצד הממברנה כלפי מעלה. סובבו בעדינות את הכוס למשך שתי דקות כדי להסיר את ציפוי המגן, והקפידו לא להפוך את השבבים. לאחר מכן, העבירו במהירות את השבבים לכוס של אתנול טהור.
מכסים את הכוס בנייר אלומיניום. סובבו בעדינות את הכוס במשך שתי דקות כדי לסיים את הסרת הציפוי והביאו אותה בצלחת פטרי סגורה לקולט האדים הלמינר. הניחו את השבבים על רקמה טרייה בחדר נקי, והקפידו לא להפוך את השבבים כשהם משתחררים מהפינצטה.
הניחו לשבבים להתייבש מספר דקות. ואז הניחו את השבבים על מגלשת הזכוכית בצלחת הפטרי. סוגרים את צלחת הפטרי ומביאים את השבבים למנקה פלזמה.
הנח את מגלשת הזכוכית והשבבים במנקה הפלזמה והפעל תוכנית ניקוי של חמש דקות כדי להסיר פחמימנים מממברנת ה-SiN. בעזרת מיקרוסקופ אור, בדוק את השבבים לאיתור ממברנות קרועות או חלקיקי לכלוך. השלך שבבים פגומים או מלוכלכים.
במכסה המנוע הזרימה הלמינרית, יש לשתק את השבבים בקופסת הובלה נקייה עם משטח פנימי דביק. מרחו טיפת מיקרוליטר אחת של תמיסת ננו-חלקיקי זהב מימית מיוצבת של שלושה ציטראט מולארי על ממברנת ה-SiN של כל שבב ללא מרווח, ואפשרו לתמיסה להתייבש. לאחר מכן, מרחו מיקרוליטר אחד של מים נטולי יונים על הממברנה כדי לשטוף מלח ופעילי שטח.
לאחר 30 שניות, השתמש בנייר סינון כדי לטפוח בזהירות את המים ולאפשר לשבבים להתייבש. הנח את קצה מחזיק ה-TEM של זרימת הנוזל מתחת למיקרוסקופ אור דו-עיני. הסר את מכסה הטיטניום מקצה המחזיק והנח אותו על יריעת נייר אלומיניום.
הגדר משאבת מזרק מיקרופלואידית עם מזרק זכוכית של מיליליטר אחד המכיל 0.5 מיליליטר מים בדרגת HPLC. חבר את המזרק למערכת הזרימה והפעל את המשאבה. כאשר המים נשטפים דרך המערכת, בדוק את הקווים לאיתור נזילות או התכווצויות זרימה.
בסיום השאיבה, הסר את השטיפה מתא תאי הנוזל וייבש את קצה המחזיק בנייר פילטר. בדוק את קצה המחזיק עם מיקרוסקופ האור. יבש את הקצה עם טישו חדר נקי והסר אבק או סיבים בעזרת פינצטה נקייה מצופה PTFE.
בדוק את מכסה קצה המחזיק, את טבעת ה-O ואת הברגים, והסר אבק או סיבים בעזרת פינצטה מצופה PTFE. הנח את טבעת ה- O בקבוצות המחזיקים. הנח את הבורג הראשון וסובב אותו כמה פעמים כך שהוא פשוט יישאר.
בעזרת פינצטה מעוקלת נקייה, הנח את שבב הדגימה בכיס קצה המחזיק כשקרום ה-SiN פונה כלפי מעלה. השתמש במיקרוסקופ האור הדו-עיני כדי לבדוק שהשבב יושב כהלכה. הנח טיפה של 0.3 מיקרוליטר מים מסוננים טהורים על שבב הדגימה.
החזקת השבב במקומו בעזרת פינצטה. לאחר מכן, הרם שבב מרווח עם פינצטה מעוקלת מוחזקת הפוך. סובב בזהירות את הפינצטה כך שקרום השבב פונה כלפי מטה.
הנח את שבב המרווח על שבב הדגימה. הנח חומר מחזיר אור מתחת לקצה המחזיק ובדוק את יישור השבב מתחת למיקרוסקופ האור המשקפת. השתמש בפינצטה כדי לכוונן בזהירות את השבבים אם חלונות ה-SiN אינם מיושרים.
לאחר מכן, הרם את מכסה תא הדגימה בעזרת פינצטה. הפוך את המכסה הפוך, ומבלי לגעת בשבבים, הנח את הצד האחורי של המכסה על קצה המחזיק. הנח את הבורג הנותר באמצעות פינצטה והדק את שני הברגים בצורה איטרטיבית.
הדק בזהירות עד שהם נתקלים בהתנגדות. חלונות יכולים להישבר בקלות אם ההידוק חזק מדי. התחל זרימת נוזלים של ארבעה מיקרוליטר לדקה דרך המערכת ובדוק אם יש נזילות בקצה המחזיק.
לאחר מכן, הביאו את המחזיק לתחנת משאבת ואקום ובצעו בדיקת נזילות. ודא שהלחץ יגיע לפחות ל-10 ל-mbar החמישי השלילי תוך חמש דקות. הנח את המחזיק במארז שלו.
והביאו את המחזיק למיקרוסקופ האלקטרונים. הגדר את המיקרוסקופ במצב STEM. מדוד את צפיפות הזרם של קרן האלקטרונים עם סרט פחמן דק המצופה בננו-חלקיקי זהב כדגימת ייחוס ללא מים.
התחל את זרימת המים הטהורים בקצב של לא יותר משני מיקרוליטר לדקה. הכנס את מחזיק ה-TEM של זרימת הנוזל למנעול עומס הוואקום והתחל בפינוי. ודא שהלחץ יורד כרגיל.
ולאחר מכן הכנס את מחזיק ה-TEM במלואו למיקרוסקופ. לאחר שהלחץ נמוך מספיק, פתח את שסתום הקורה והכנס את גלאי מזין המסמכים האוטומטי. הגדר את המיקרוסקופ למצב רכישה רציף ותרגם את שלב הדגימה בכיווני X ו-Y כדי למצוא את חלון ה-SiN.
כוונן את הניגודיות והבהירות כך שקצוות החלון יהיו גלויים בבירור. תרגם את הבמה לכיווני X ו-Y כך שפינה של החלון תהיה במרכז שדה הראייה. לאחר מכן אפס את עדשת האובייקטיב.
התאם את המיקום האנכי של שלב הדגימה כדי למקד את הפינה בגסות. הטה את הבמה בחמש מעלות קדימה ואחורה כדי לבדוק שהדגימה נמצאת בגובה האוצנטרי. מרכז את פינת החלון בשדה הראייה ולאחר מכן אחסן את מיקום הבמה בתוכנה.
תרגם את השלב בכיווני X ו-Y עד שננו-חלקיקי הזהב נראים לעין. ואז למקד את עדשת האובייקטיב. שימו לב לצפיפות הנוכחית וחישבו את עובי התא הנוזלי.
תרגם את השלב לכיווני X ו-Y כדי לאתר אזור עם לפחות 20 ננו-חלקיקי זהב. הגדר את הפרמטרים ורכוש תמונה. ננו-חלקיקי זהב אנו משותקים על קרום סיליקון ניטריד ומצולמים עם STEM פאזה נוזלית.
במים טהורים, ננו-חלקיקי הזהב שמרו על צורתם לאורך כל ההדמיה. תוצרי רדיוליזה מהמים יכולים לחמצן אטומי זהב בודדים שיכולים בסופו של דבר לשנות את צורת הננו-חלקיקים. בניסוי אחר, יוני כלוריד אנו מוכנסים לשלב הנוזל.
ננו-חלקיקי הזהב התמוססו לאט במהלך הניסוי כאשר אטומי הזהב המחומצנים יצרו טטרכלואוריאט מסיס. כדי לחקור את תנועותיהם של ננו-חלקיקי זהב במים, בניסוי שלאחר מכן, הננו-חלקיקים לא היו משותקים לחלוטין על קרום הדגימה. ננו-חלקיקי הזהב הצטברו וכאשר הגיעו לגודל צביר קריטי, יצאו משדה הראייה.
לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעתיים אם היא מבוצעת כראוי. יידרשו מספר שבועות של הכשרה. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעבוד ברוגע ולבדוק את אטימות הוואקום ועובי הנוזל.
לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים במדעי החומרים, כימיה וביולוגיה לחקור צמיחה ותנועה של ננו-חלקיקים בנוזל, את המבנה של חומרים ננומטריים בסביבות נוזליות ואת הפונקציונליות של חלבונים בתאי יונקים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לבצע מיקרוסקופ אלקטרונים שידור סריקה של ננו-חלקיקי זהב המוטבעים בשכבת מים כולל טעינה נכונה של מחזיק הדגימה והתאמת המיקרוסקופ. אל תשכח שעבודה עם נוזל במיקרוסקופ אלקטרונים עלולה לגרום לנזק אם מחזיק הדגימה אינו נטען כהלכה.
לכן חשוב לבדוק אם יש דליפת ואקום לפני הטעינה.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את התפעול של מחזיק דגימות בזרימה נוזלית עבור מיקרוסקופיית אלקטרונים חודרת עם סריקה (STEM) של AuNPs במים, המאפשר תצפית על תהליכים דינמיים בקנה מידה ננומטרי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מיקרוסקופיה אלקטרונית בשידור עם סריקה (STEM)
- ננו-חומרים
- דימוי במופע נוזלי
רקע
- מיקרוסקופיית אלקטרונים בשידור עם סריקה בשלב נוזלי (Liquid phase scanning transmission electron microscopy) מאפשרת תצפית על ננו-חומרים בסביבה נוזלית.
- טכניקה זו מספקת מידע מורפולוגי ברמת הננו על דגימות.
- היא שימושית במיוחד לחקר דגימות ביולוגיות במצב הנוזלי הטבעי שלהן.
- משתמשים חדשים עשויים למצוא את טעינת הדגימה ואת רכישת התמונה כמאתגרות.
מטרת המחקר
- לתצפית על מבנים ותופעות של ננו-חומרים בדגימות ביולוגיות.
- לחקירת התנהגותם של ננו-חומרים בנוזל.
- לשיפור ההבנה של תהליכים דינמיים בקנה מידה ננומטרי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ניקוי והכנה של מיקרוצ'יפים מ-SiN לטעינת דגימות.
- מריחת תמיסת ננו-חלקיקי זהב על המיקרוצ'יפים.
- שימוש במחזיק TEM לזרימה נוזלית לצורך הדמיה.
- ביצוע בדיקות דליפה ווידוא יישור נכון של המיקרוצ'יפים.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מדגים בהצלחה את ההכנה והדימוי של AuNPs בסביבה נוזלית.
- הוא מפרט את השלבים להבטחת שלמות הדגימה במהלך התהליך.
- התוצאות מעידות על יעילותו של מחזיק הזרימה הנוזלית בלכידה של תהליכים דינמיים.
מסקנות
- שיטה זו מספקת תובנות בעלות ערך לגבי התנהגותם של ננו-חומרים בנוזל.
- היא משפרת את יכולות המיקרוסקופיה האלקטרונית לחקר דגימות ביולוגיות.
- יישומים עתידיים עשויים להתרחב לתחומים שונים במדע החומרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיקרוסקופיית אלקטרונים בשידור עם סריקה בשלב נוזלי (Liquid phase scanning transmission electron microscopy) מאפשרת תצפית ישירה על התנהגותם של ננו-חומרים בסביבות נוזליות רלוונטיות פיזיולוגית, ובכך תומכת בתיקוף של מטרות באמצעות הפחתת סיכונים מכניסטיים באינטראקציות בין ננו-חלקיקים למערכות ביולוגיות. יכולת זו מגבירה את הביטחון החזוי במודלים פרה-קליניים על ידי לכידה של תהליכים דינמיים כגון אגלומרציה, המסה וספיגה תאית תחת תנאי נוזל מבוקרים. השיטה נותנת מענה לפער קריטי בפיתוח תרופות ננו-רפואיות על ידי אספקת רזולוציה בקנה מידה ננומטרי במצבים הידרטטיים, מה שמפחית את ההסתמכות על בדיקות הסקת מסקנות ומשפר את קבלת החלטות ה-go/no-go בשלבי הגילוי המוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה של שינויים מבניים בננו-חומרים בנוזל, ובכך מבהיר מנגנוני פעולה ומסלולי פירוק.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף תפקודי של מטרות באמצעות תצפית ישירה על אינטראקציות של ננו-חלקיקים עם רכיבים ביולוגיים בתנאים הקרובים למצב טבעי.
- ערך חיזוי: תומך בסינון תיקי פיתוח על ידי זיהוי מוקדם של ננו-חומרים לא יציבים או תגובתיים, ובכך מפחית את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים עקב התנהגות בלתי צפויה בשלב הנוזלי.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: הכנת מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לתהליכי עבודה המשכיים, על ידי אישור יציבות ופיזור של ננו-חומרים במדיה נוזלית לפני ביצוע סריקה בעלת תוכן גבוה (high-content screening).
- תוצרים כמותיים: מאפשר מדידה של שינויים בגודל החלקיקים, בצורתם ובריכוזם לאורך זמן, ובכך מספק מדדים הניתנים לשחזור לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: מקל על מוכנות הסריקה והיכולת להרחבת קנה המידה (scalability) באמצעות הכנה סטנדרטית של שבבי מיקרופלואידיקה והרכבת מחזיק אטום לדליפות, התומכים בשימוש חוזר בספריות תרכובות שונות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מגשרת בין הגילוי לוולידציה פרה-קלינית על ידי שמירה על ננו-חומרים בסביבות נוזליות המדמות תנאים פיזיולוגיים, ובכך משפרת את הרלוונטיות של מדדי היעילות והרעילות.
- החלטות מותאמות סיכון: מספקת מידע לקריטריונים של קידום על ידי כימות תהליכים דינמיים כגון התמוססות מושרית-יונים או אגלומרציה, המשפיעים ישירות על פרופילי הזמינות הביולוגית והבטיחות.
- הורדת סיכונים מכניסטית: מתמקדת בהורדת סיכונים חזויה כאשר המיקוד הוא בעיקר מכניסטי, ומבהירה האם ההשפעות שנצפו נובעות מהננו-חומר עצמו או מתוצרי טרנספורמציה בפאזה הנוזלית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל משלב הגילוי המוקדם, דרך זיהוי מובילים (Lead Identification) ועד לעבודה פרה-קלינית, ותומכת בבחינת השערות, במוכנות של בדיקות (assay readiness) וברציפות תרגומית כאשר חומרים ננומטריים מוערכים בסביבות נוזליות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי מתן אפשרות לוויזואליזציה ישירה של התנהגות ננו-חומרים בנוזל, ובכך מפחית עמימות מנגנונית במחקרי מעורבות במטרה.
- סריקה: מתאר את מוכנות הבדיקה באמצעות יצירת תא נוזלי הניתן לשחזור וקיבוע של ננו-חלקיקים, מה שמבטיח תנאי התחלה עקביים להערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מדגיש את מדידת עובי הנוזל ומעקב אחר ננו-חלקיקים כמדדי קריאה מרכזיים המסייעים לצוותים להשוות יציבות בין פורמולציות שונות או תנאים סביבתיים.
- מחקר תרגומי: מקשר את השיטה להמשכיות פרה-קלינית על ידי שמירה על ננו-חומרים במצבים מהוורט המשקפים חשיפה in vivo, ובכך תומך בהתאמה של סמנים ביולוגיים כאשר תוצרי המסה או אגלומרטים נמצאים במתאם עם תגובה ביולוגית.
- שימוש חוזר ארגוני: מגדיר את השיטה כיכולת הניתנת לשימוש חוזר באמצעות הכנה סטנדרטית של שבב מיקרו-פלואידי, הרכבת מחזיק ופרוטוקולים לבדיקת דליפות, מה שמאפשר יישום עקבי בין פרויקטים וצוותים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי, תיקוף מטרה, והפחתת עמימות מכניסטית באינטראקציות בין ננו-חומרים למערכות ביולוגיות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, שחזוריות ויכולת הרחבה (scalability) של תהליכי הכנת תאים נוזליים וזרימות עבודה של דימוי.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go), יעילות הונית והפחתת סיכונים ביולוגיים בשלבים מאוחרים באמצעות זיהוי מוקדם של ננו-חומרים לא יציבים.
- השפעה על תיק הפיתוח: תעדוף והחלטות קידום מותאמות סיכון, המבוססות על תצפית ישירה על יציבות וטרנספורמציה בפאזה נוזלית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיפול במיקרופלואידקה, במערכות ואקום ובמיקרוסקופיה אלקטרונית כדי להבטיח הרכבה תקינה של מחזיק הדגימה ובדיקת נזילות.
- תלוי במכשור הכולל מכשירי ניקוי בפלזמה, מחזיקי TEM לזרימה של נוזלים, ומיקרוסקופים בעלי יכולת STEM עם מחזיקים סביבתיים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של ניקוי השבב, שימוש במרווחים (spacers) ופרוטוקולים של קצב זרימה כדי להבטיח הדירות בין אתרים שונים.
- כולל שיקולי התאמה בעת מעבר ממסבים מבוססי מים למסבים ביולוגיים מורכבים, כולל השפעות צמיגות וסבירות לסתימת הממברנה.
- כולל מגבלות מעשיות כגון השפעות רדיולייזה מושרית-קרן על הכימיה של הנוזל והצורך בתאימות לוואקום, מה שעשוי להגביל פורמולציות נדיפות או רגישות מסוימות.
