מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור של שורשי הצמח גדל על פני השטח של ג'ל
18 בינואר 2017
פרוטוקול זה מציג שיטת הכנת דגימת צמחים למיקרוסקופיה של גיליון אור. ההתקנה מאופיינת בהרכבה אנכית של הצמח על פני ג'ל ומאפשרת לו לצמוח בתנאי אור מבוקרים. זה מאפשר תצפית ארוכת טווח על התפתחות איברי הצמח בתנאים סטנדרטיים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לרכוש תצפיות ארוכות טווח של מערכת שורשי צמחים באמצעות מיקרוסקופ יריעות אור. כדי להשיג זאת, חיוני שתהיה שיטת הכנת דגימה עדינה, תנאי גידול מבוקרים וטכניקת הדמיה שאינה משנה את התפתחות הצמח, כגון מיקרוסקופ יריעות אור. ראשית, צמחים מגדלים על פני שכבת ג'ל דקה של שני מילימטרים.
לאחר מכן חותכים את הג'ל עם שתיל Aribidopsis, נאספים ומועברים למחזיק דגימת המיקרוסקופ. בתוך המיקרוסקופ הצמח גדל במצבו הזקוף הטבעי. השורשים גדלים במדיום נוזלי, ואילו העלים נשארים באוויר.
מערכת תאורה מאירה רק את העלים. פני המים מכוסים על מנת לשמור על השורשים בחושך. אחד היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות, כמו הטמעת השורש בתוך הג'ל הוא שאנו רגילים לגידול צמחים על פני ג'ל.
לכן, אנו יכולים לדבוק באותו פרוטוקול גידול בדיוק כמו קודם. ושנית, השורש נמצא במגע ישיר עם המדיום הנוזלי, אותו ניתן להחליף לטיפולים תרופתיים, למשל. יוצקים 30 מיליליטר של מדיום MS טרי בחצי חוזק המכיל 1.5 אחוז פיטוג'ל בצלחת פטרי מרובעת ליצירת שכבה של כ -2 מילימטרים.
זרעו זרעים סטריליים זה לצד זה עם רווח של סנטימטר אחד לפחות ביניהם. לאחר מכן, עטפו את הצלחת בסרט מיקרו-נקבוביות. טפחו את הצלחת בחממת הגידול שלכם בצורה אנכית עד 10 ימים.
בניסוי הזה אנו משתמשים בצמחים בני שישה ימים כדי לצפות בהתפתחות של שורשים צדדיים. אנו מספקים דגם להדפסת תלת מימד של מחזיק המדגם. בדקנו חומרים שונים.
השרפים השקופים היו המתאימים ביותר מבחינת קשיחות ועמידות במים. תיאור מפורט של המידות לעיבוד מחזיק דגימה מחומר מוצק מתואר בכתב היד. חותכים את הג'ל סביב הצמח בעזרת אזמל.
לאחר מכן, גרפו את גוש הג'ל שעליו גדל הצמח והעבירו אותו בזהירות למחזיק הדגימה. ממיסים 1 אחוז אגרוס ב-80 מעלות צלזיוס ומצננים אותו ל-33 מעלות צלזיוס. הדביקו את גוש הג'ל על מחזיק המדגם והדביקו את הצמח על הג'ל בזהירות.
השתמש במיקרוסקופ סטריאו כדי לאמת את מיקום הצמח ולוודא שאזור העניין אינו מכוסה בג'ל כלשהו. על מנת למנוע מהצמח להתייבש, החלק את מחזיק הדגימה על קצה פיפטה של 1,000 מיקרוליטר במידת האפשר. הניחו את המחזיק על קופסת פיפטה והכינו דוגמאות נוספות במידת הצורך.
המיקרוסקופ שלנו הוא ספין פתוח קלאסי ללא שינויים גדולים. הטמענו מערכת תאורה לגידול צמחים בתוך המיקרוסקופ. נוריות LED אדומות וכחולות מסודרות בטבעת.
ניתן להדליק ולכבות זוגות נוריות LED בנפרד לתאורה כיוונית. הספקטרום של מערכת התאורה תואם לזה שבתאי הגידול שלנו. כמעט כל התאורה שמגיעה מהנוריות חסומה על ידי מסנן פליטה עבור GFP.
לא הצלחנו לזהות שום אור תועה שמגיע למצלמה. לפיכך, ניתן לשמור על האור דולק בזמן ההדמיה. ניתן לכוונן את עוצמת האור, הנעה בין 30 ל -250 מיקרו שומות למטר מרובע לשנייה.
הברג או הדבק את טבעת ה-LED בצד התחתון של זרוע שלב הסיבוב הפתוחה. הרכיבו אותו בחזרה למיקרוסקופ וחברו את החוטים. הרכיבו את מערכת השפע.
חבר את הצינורות לתא הדגימה בסידור חד כיווני. התאם את המהירות למיליליטר אחד לדקה. מוסיפים שלושה ריבועים של שלושה מילימטר של נייר כסף שחור סטרילי ומחלקים אותם על פני המים.
הכנס את הדגימה למיקרוסקופ. ודא שאין יריעות פלסטיק שנדבקות למחזיק המדגם. סגור את החדר עם שני מכסים עשויים נייר אלומיניום שחור.
הפעל את האור והתאם את עוצמת האור. כבה את תאורת החדר והתחל להקליט. שיטה זו מאפשרת לתעד צמיחת שורשים לאורך מספר שעות עד ימים, המוצגת כאן על ידי צמיחת שורש לרוחב.
תמונות של מחסנית z של נקודת זמן אחת מראות תכונות חתך אופטיות טובות. לכדנו את כל התהליך של היווצרות שורשים רוחבית בתלת מימד, מה שמאפשר לנו לחקור את הדינמיקה של תהליך זה. התבוננות בקטע בודד של הקלטה זו מראה רזולוציה טובה, אפילו עמוק בתוך השורש.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה ברורה של שיטת הכנת דגימת הצמח למיקרוסקופ גיליון אור. בעקבות פרוטוקול זה, אנו מסוגלים כעת להסתכל על לוקליזציה של חלבון תוך תאי או דפוסי ביטוי גנים במהלך בראשית אורגנית, טרופיזמים של צמחים או הסתגלות צמחית. זה יעזור לנו להבין את הוויסות המרחבי-זמני של התפתחות הצמח.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מדגים שיטה להכנת דגימות צמחים עבור מיקרוסקופיית light-sheet, המאפשרת תצפית ארוכת טווח על התפתחות איברי הצמח. המערך כולל גידול של צמחים על פני שטח של ג'ל תחת תנאים מבוקרים, מה שמאפשר הדמיה מפורטת מבלי לשנות את צמיחת הצמח.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביולוגיה של הצומח
- טכניקות מיקרוסקופיה
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- מיקרוסקופיית גילי-אור (Light-sheet microscopy) מספקת טכניקה של דימוי לא פולשני.
- שיטות מסורתיות עלולות לשנות את התפתחות הצמח.
- תנאים מבוקרים הם קריטיים להשגת תצפיות מדויקות.
- נבטי Arabidopsis משמשים באופן נפוץ למחקרים מעין אלו.
מטרת המחקר
- להשגת תצפיות ארוכות טווח של מערכות שורשים של צמחים.
- לפיתוח שיטה עדינה להכנת דגימות.
- להשתמש בטכניקות דימות שאינן מפריעות לצמיחת הצמח.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- צמחים גדלים על שכבה דקה של ג'ל.
- בלוק הג'ל מועבר למחזיק דגימות של מיקרוסקופ.
- מערכת תאורה מיושמת כדי להבטיח תנאי גידול אופטימליים.
- דימוי לוכד את דינמיקת גדילת השורשים לאורך זמן.
תוצאות עיקריות
- דימוג מוצלח של היווצרות שורשים צדדיים בתלת-ממד.
- תכונות אופטיות טובות שנצפו בתמונות z-stack.
- השיטה מאפשרת חקר של תהליכים תוך-תאיים.
- מסייעת להבנת הבקרה המרחבית-זמנית בצמחים.
מסקנות
- שיטה זו משפרת את היכולת לצפות בהתפתחות הצמח.
- היא תומכת במחקר על ביטוי גנים ומיקום חלבונים.
- מספקת גישה סטנדרטית למחקרים עתידיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מאפשר דימוי ברזולוציה גבוהה לטווח ארוך של מערכות שורשים של צמחים בתנאים מבוקרים, ובכך הוא תומך במחקרים מכניסטיים של אורגנוגנזה ודינמיקה התפתחותית. על ידי שימור הצמיחה הטבעית תוך מתן אפשרות להחלפת מצע נוזלי, הוא מקל על סריקת תרכובות ותיקוף מטרות במערכות מודל מבוססות צמחים. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי קישור פנוטיפים תאיים לתגובות ברמת הרקמה בפורמט הניתן לשחזור ולהרחבה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות תצפית ישירה על דינמיקה תאית במהלך אורגנוגנזה.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות ויזואליזציה של מעורבות המטרה ברקמות שלמות בתהליכי התפתחות.
- ערך ניבוי: מקשר בין הפרעות מולקולריות לתוצאות פנוטיפיות בהקשר פיזיולוגי רלוונטי.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מוכנות הבדיקה: הכנת מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף להערכת תרכובות בהמשך, עם יכולת להחלפת מצע נוזלי.
- תוצרים כמותיים: יצירת מערכי נתונים זמניים בתלת-ממד המאפשרים מדידה מדויקת של שינויים מבניים ותפקודיים.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: תכנון סטנדרטי של מחזיק הדגימות מאפשר סקילביליות לאורך מספר קמפיינים ניסיוניים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מספק מערכת רלוונטית למחלה לצורך חקר טרופיזמים של שורשים ותגובות מסתגלות לגירויים סביבתיים.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין דימוי בשלב הגילוי לבין תיקוף פרה-קליני באמצעות מדדים עקביים ולא פולשניים.
- הפחתת סיכונים מנגנונית: מפחית עמימות בתיקוף המטרה על ידי קורלציה בין שינויים מולקולריים להתפתחות מבנית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ועד לזיהוי מובילים (lead identification), ומאפשרת זיקוק איטרטיבי של מטרות ביולוגיות בהתבסס על נתונים פנוטיפיים דינמיים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בהבהרת מסלולים באמצעות ויזואליזציה של תהליכים תאיים בזמן אמת בתוך ארכיטקטורת רקמה טבעית.
- סריקה: מאפשרת הערכה מהימנה של תרכובות באמצעות קיבוע סטנדרטי ופרפוזיה של מצע נוזלי.
- אנליטיקה: מספקת תוצאות מרחביות-זמניות ברזולוציה גבוהה המקלות על ניתוח השוואתי בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשרת תובנות מכניסטיות מוקדמות למודלים פרה-קליניים באמצעות תהליכי התפתחות שמורים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמת דימיון הניתנת לשימוש חוזר וניתנת להתאמה למינים שונים של צמחים ולמשתנים ניסויים מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בתיקוף המטרה.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות קיבוע סטנדרטי מבוסס ג'ל ותאורה מבוקרת.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת הפרויקט (go/no-go) על ידי אספקת ויזואליזציה ישירה של תגובות ביולוגיות להפרעות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון באמצעות נתונים פנוטיפיים כמותיים ואורכיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביולוגיה של צמחים, מיקרוסקופיה וטיפול בדגימות במיקרופלואידיקה.
- תלוי בתשתיות של מיקרוסקופיית light-sheet עם תאורת LED ניתנת להתאמה ובקרה סביבתית.
- מחייב סטנדרטיזציה של הכנת הג'ל, העברת הדגימות ופרוטוקולי תאורה בין צוותים.
- כולל שיקולי התאמה עבור מיני צמחים שונים, מצעי גידול ופרופילי מסיסות של תרכובות.
- מוגבל על ידי הצורך בשקיפות אופטית ובתאימות בין חומרי הג'ל לאורכי הגל של הדימוי.
