Assay לימפוציטים הקרינה מבוסס מתאים להקרנה תפוקה גבוהה של מולקולות קטנות
10 במרץ 2017
אנו מציגים במחקר הנוכחי הוא assay קרינה מבוססת רומן באמצעות לימפוציטים נגזר עכבר מהונדס. Assay זה מתאים להקרנה תפוקה גבוהה (HTS) של מולקולות קטנות ניחן קיבולת אחד עיכוב או קידום ההפעלה הלימפוציטים.
המטרה הכוללת של בדיקת לימפוציטים מבוססת תפרחת זו היא לזהות אימונומודולטורים חדשים של מולקולות קטנות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה לגבי מנגנון ההפעלה והעיכוב של לימפוציטים. היתרון העיקרי של פונקציה פנוטיפית ובדיקה זו, שניתן להתאים אותה לגילוי תרופות.
מי שידגים את ההליך יהיה אחמד פודה, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלנו. מתחת למכסה מנוע סטרילי, יש לחטא את הפרווה של נקבת עכבר Nurr77 GFP בת שישה עד שמונה שבועות עם 70% אתנול, ולהניח את החיה על צדה הימני. לאחר מכן, בצע חתך בעור ובשרירים של רבע הבטן השמאלית העליונה, ואתר והסר את הטחול, והניח את הרקמה למדיום טחול על קרח.
לאחר איסוף כל הטחול, העבירו את הרקמות לצלחת תרבית תאים בגודל 10 סנטימטרים רבועים המכילה חמישה מיליליטר של מדיום טחול שחומם מראש, והשתמשו בבוכנת מזרק סטרילית כדי לרסק את הרקמות עד שהתמיסה עכורה. לאחר ריסוק נרחב במדיום הטחול, סנן את תרחיף התאים דרך מסננת תאים של 70 מיקרון לתוך צינור של 50 מיליליטר כדי להסיר כל פסולת, וצנטריפוגה את תרחיף התא הבודד שנוצר. השעו מחדש את הגלולה בשניים עד שלושה מיליליטר של מאגר ליזה של כדוריות דם אדומות, וספגו את התגובה עם חמישה מיליליטר RPMI, או מאגר מתאים אחר, לאחר 20 עד 30 שניות.
לאחר מכן אסוף את התאים עם צנטריפוגה נוספת, והשהה מחדש את הגלולה ב-twp מיליליטר של מדיום טחול לספירת תאים. כדי לבודד את תאי ה-T, יש לצנטריפוגה שוב את התאים, ולהשעות מחדש את הגלולה במדיום RPMI חופשי בסרום בריכוז אחד כפול 10 לשבעה תאים למיליליטר. העבירו את התאים לשפופרת פוליסטירן של חמישה מיליליטר, והניחו בצד 100 מיקרוליטר של טחול שישמש מאוחר יותר להערכת טוהר.
לאחר מכן, הוסף לתאים 50 מיקרוליטר למיליליטר של סרום חולדה רגיל, ואחריו תוספת של 50 מיקרוליטר למיליליטר של קוקטייל נוגדנים לבידוד תאי T עם ערבוב עדין. לאחר 10 דקות, דגרו את התאים עם חרוזים מגנטיים מצומדים של סטרפטווידין למשך שתי דקות וחצי. לאחר מכן, הוסף מדיום נטול סרום לתאים לנפח סופי של שניים וחצי מיליליטר, והנח את הצינור במגנט בידוד תאים למשך שלוש דקות.
בסוף הדגירה, החזק את הצינור במגנט, שפכו את הסופרנטנט לתוך צינור פוליסטירן חדש בתנועה אחת. לאחר מכן ניתן לספור את תאי ה-T. זרעי תאי T לצלחת תחתונה עגולה של 96 בארות בריכוז של 2.5 כפול 10 עד חמישית תאים לבאר המכילה 200 מיקרוליטר של מדיום טחול טרי לבאר.
הוסף חרוזים מגנטיים רקומביננטיים אינטרלוקין 7 ו- CD3 / CD28 לבארות המתאימות, והנח את הצלחת בחממת תרבית תאים. 12 שעות לאחר מכן, יש לשלש בעדינות את תרחיף התאים בכל באר כדי לפרק את כל אגרגטים של תאי חרוזים. לאחר מכן העבירו את מתלי התאים מכל באר לצינורות פוליסטירן בודדים של חמישה מיליליטר.
לאחר שכל התאים נאספו, הניחו כל צינור של תאים לתוך מגנט ההפרדה למשך חמש דקות בכל פעם, ושפכו את הסופרנטנטים כאשר הצינור עדיין בתוך המגנט, לתוך צינורות פוליסטירן חדשים בסוף כל דגירה. לאחר מכן אוספים את התאים על ידי צנטריפוגה, ומשעים מחדש את הכדורים במדיום טחול טרי בריכוז כפול 10 עד שישי תאים למיליליטר. לבדיקת תפוקה גבוהה של מולקולות קטנות, צלח 40 מיקרוליטר תאים לבאר בצלחת של 384 בארות, וטפל בבארות המתאימות עם התרופה או הרכב הנבחר לתקופת הטיפול הרצויה בחממת תרבית התאים.
30 דקות לפני ניתוח ה- GFP, יש לצבוע את התאים בריכוז המתאים של תמיסת Hoechst, ולהפיץ היטב את הכתם בפיפטינג עדין. כאשר כל הבארות נצבעו, צנטריפוגה את הצלחות כדי לאסוף את התאים בתחתית הבארות, ואפשרו לתאים לנוח במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. טען את הצלחת לפי הוראות היצרן.
לאחר מכן, הגדר את היעד ל-40X ומעלה. הגדר מצלמה מספר ארבע עבור מנורת ה-UV ולאחר מכן הגדר מצלמה מספר אחת עבור לייזר 488. טען את הצלחת למערכת הסינון בעלת התוכן הגבוה.
לאחר מכן, הגדר את מערכת הסינון האוטומטית של תוכן גבוה קונפוקלי לקריאת שישה עד 10 שדות לבאר עם שתי קריאות עוקבות לכל שדה, ב-488 ננומטר ואור UV. תאי T חיוביים CD3 מייצגים כ-30% מטחול עכבר נתון, ומדגימים ביטוי GFP בסיסי של 10%. בעקבות גירוי חרוזי קולטן תאי T CD3/CD28, נצפתה עלייה של פי חמישה עד שישה באחוז ביטוי ה-GFP.
כמו כן, תאי B חיוביים ל-CD19 מייצגים 50 עד 55% מכלל הטחול עם ביטוי GFP בסיסי דומה לזה של תאי T לא פעילים. מעניין שגירוי קולטני תאי B באמצעות IgG, IgM ו-CD40L רקומביננטי נגד עכברים, מעורר רק עלייה טריוויאלית בביטוי GFP. לאחר בידוד חרוזים מגנטיים כפי שהודגם זה עתה, תאי ה-T החיוביים CD3 המבודדים עדיין מציגים ביטוי GFP בסיסי של 10%.
גירוי חרוזי CD3/CD28 לעומת זאת, גורם לוויסות משמעותי של תגובת ה-GFP. באופן דומה, לאחר בידוד חרוזים מגנטיים של תאי B, תאי B המופעלים המטוהרים מציגים ביטוי גבוה יותר של GFP בהשוואה לתאי B מופעלים בטחול. בניסוי מייצג זה, סינון ראשוני בתפוקה גבוהה של 4398 תרכובות חשף מספר מפעילים ומעכבים של הפעלת תאי T.
אבל ביטוי ה-GFP שנצפה של תאי ה-T המגורים, גבוה פי 20 מזה שנמדד עבור תאי ה-T הלא מגורים. מאפשר יצירת חלון של אזור פעולה שבו ניתן לזהות בקלות את התרכובות המעכבות של GFP. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך 36 עד 48 שעות אם היא מבוצעת כראוי.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לספור את התאים לאחר כל שלב. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ELISA או Western Blotting כדי לענות על כל שאלה נוספת אחרת. טכניקה זו תסלול את הדרך לאימונומודולציה של גילוי תרופות במכרסמים.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד ולהפעיל תאי T או B שמקורם בלוחות העכבר Nurr77 GFP.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג בדיקה פלואורסצנטית חדשנית המשתמשת בלימפוציטים מעכבר טרנסגני, במטרה לבצע סריקה ברחבי רחב (high-throughput screening) של מולקולות קטנות המסוגלות למודולציה של הפעלת לימפוציטים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- אימונולוגיה
- גילוי תרופות
- ביולוגיה של התא
רקע
- הבדיקה מתמקדת בזיהוי של מודולטורים חיסוניים בעלי מולקולות קטנות.
- היא עונה על שאלות מרכזיות בנוגע למנגנוני הפעלה של לימפוציטים.
- השיטה ניתנת להתאמה ליישומים של גילוי תרופות.
- הדגמת הפרוצדורה מבוצעת על ידי סטודנט לתואר מתקדם.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לסריקה בעתקת תפוקה גבוהה עבור אימונומודולטורים.
- העמקת ההבנה של הפעלה ועכבה של לימפוציטים.
- אספקת פלטפורמה למאמצי גילוי תרופות עתידיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- פיתוח בדיקה מבוססת פלואורסצנציה.
- בידוד לימפוציטים מעכברים טרנסגניים Nurr77 GFP.
- סריקה בסבירות גבוהה (High-throughput) של מולקולות קטנות.
- ניתוח in vitro של הפעלת לימפוציטים.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של מולקולות קטנות המווסתות את תפקוד הלימפוציטים.
- הוכחת יכולת ההתאמה של הבדיקה לתהליכי גילוי תרופות.
- אספקת תובנות לגבי מנגנוני ההפעלה של לימפוציטים.
- ביסוס שיטה אמינה למחקרי אימוןולוגיה עתידיים.
מסקנות
- בדיקה מבוססת פלואורסצנציה היא כלי מבטיח למחקר בתחום האימונולוגיה.
- היא יכולה לסייע בגילוי של תרופות אימונומודולטוריות חדשות.
- המחקר תורם להבנה מעמיקה יותר של הביולוגיה של הלימפוציטים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
סריקה פנוטיפית בסביבת עיבוד נתונים גבוהה (High-throughput) של הפעלת לימפוציטים באמצעות בדיקה מבוססת פלואורסצנציה מאפשרת זיהוי מהיר של מולקולות קטנות בעלות השפעה אימונו-מודולטורית ללא היפותזה מוגדרת מראש לגבי המטרה. פלטפורמה זו תומכת בשלבים מוקדמים של גילוי תרופות באימונולוגיה ובהשתלות על ידי אספקת תוצאות כמותיות וניתנות להרחבה של תגובות תאי T ותאי B. יכולת ההסתגלות והסביבתיות של הבדיקה ממצבות אותה ככלי קריטי למיון תיקי פיתוח ולהפחתת סיכונים מכניסטיים בקווי פיתוח של חומרים אימונו-מודולטוריים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של היפותזות אימונומודולטוריות בלימפוציטים ראשוניים באמצעות מדדים פונקציונליים.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי כימות של אקטיבציה ועכבה במגוון ספריות של תרכובות.
- מסייע בביסוס ביטחון חיזוי בסריקה שאינה תלויה במטרה עבור מודולטורים חיסוניים חדשים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מספק תוצאות כמותיות סטנדרטיות המבוססות על GFP לצורך הערכה של תרכובות בסריקה רחבה.
- מבטיח הדירות ויכולת התרחבות באמצעות דימות קונפוקאלי אוטומטי ופורמטים של רב-בארים.
- מכין מערכות תאיים מאושרות לבדיקות מכניסטיות או משניות בהמשך התהליך.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מסלולים חיסוניים הרלוונטיים למחלה על ידי מידול של הפעלת תאי T ותאי B in vitro.
- מספק המשכיות מסריקה פנוטיפית ועד לאישור in vivo של מועמדים בעלי השפעה אימונומודולטורית.
- מאפשר קידום של מועמדים מותאם סיכון, המבוסס על פרופילי מודולציה חיסונית פונקציונליים.
שילוב זרימת עבודה וצנרת עיבוד
בדיקת לימפוציטים מבוססת פלורסצנציה זו משתלבת בשלבי הגילוי המוקדמים וזיהוי המולקולה המובילה (lead identification), ומגשרת בין סריקה פנוטיפית לבין מעקב מכניסטי ותיקוף פרה-קליני.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בסריקה ללא השערות ובבירור מסלולים בהפעלה של תאי מערכת החיסון.
- סריקה: מציעה תוצאות כמותיות חסונות להערכה בתושבה גבוהה של אלפי תרכובות.
- אנליזה: מספקת מדידות של עוצמת GFP להשוואת מצבי הפעלה וזיהוי מודולטורים.
- מחקר תרגומי: מקלה על בחירת מועמדים למחקרי אימונולוגיה נוספים in vitro ו-in vivo.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתן להתאמה לסוגים שונים של תאי מערכת החיסון ולספריות תרכובות ליישום רחב בפורטפוליו.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בגילוי של immunomodulators.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה והאצה של תהליכי סינון עם תוצריים הניתנים לשחזור ובקנה מידה רחב.
- ערך אסטרטגי: שיפור קבלת החלטות לגבי המשך התקדמות (go/no-go) ויעילות הון על ידי אפשור מיון תפקודי מוקדם.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים וקידום של מועמדים immunomodulatory.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בבידוד לימפוציטים ראשוניים ובדימוי פלואורסצנציה בעל תוכן גבוה (high-content fluorescence imaging).
- נדרשת גישה לפלטפורמות סריקה קונפוקאליות אוטומטיות ותשתיות אנליטיות.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית של הכנת התאים ותנאי הבדיקה.
- ניתן להתאימה לסוגי תאי חיסון שונים ולספריות תרכובות באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- תלוי בבקרות חיוניות והפעלה חסונות של התאים לצורך פרשנות נתונים מהימנה.
שאלות נפוצות בביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Generation of Splenocyte Cell Suspension from Nur77GFP Mouse Spleens
2:07
T Cell Isolation from the Splenocyte Cell Suspension
3:26
T-cell Activation and the Induction of GFP Expression
4:42
High Throughput Screening of Small Molecule
6:05
Results: T and B Cell Receptors Activation Flowcytometry Results and a Representative T Cell HTS of Smal Molecules
7:56
Conclusion
