שיטות העצמי הוא השילוב של Biopolymers Megamolecular על ממשק האוויר-LC הייבוש

המטרה הכללית של ניסוי זה היא להעריך את השפעת הממשק בין האוויר המייבש לגביש הנוזלי (air-LC interface) על אוריינטציה של ביופולימרים מגא-מולקולריים, כגון פוליסכרידים, מיקרוטובוליים ו-DNA, כפי שבאים לידי ביטוי בהתנהגויות דינמיות הנצפות בקנה מידה של מילימטרים. מסר זה עשוי לסייע במענה על שאלות מפתח בתחומי מבני הפיזור, כגון ארגון עצמי של ביופולימרים בסביבת ייבוש, בדומה לתהליך שבו יצאו אורגניזמים חיים אל היבשה לפני כ-500 מיליון שנים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת צפייה בדגמה מהצד במהלך תהליך הייבוש, ללא ייבוש במישור האופקי.

כדי להתחיל בהליך זה, הוסיפו 0.5 גרם של sacran ל-100 מיליליטר של מים. כסו את הכלי בניילון נצמד וערבבו את התמיסה בטמפרטורה של כ-80 degrees celsius למשך יותר מ-12 שעות. לאחר קירור של תמיסות ה-sacran וה-xantham gum, צנטריפיגו את תמיסת ה-sacran כדי להסיר זיהומים.

כעת, הכינו על קרח תמיסת טובולין בריכוז של 0.5% משקל בבופר Britton-Robinson. ערבבו 50 µL מתמיסת הטובולין עם 5 µL של GpCpp. לאחר מכן, דגרו את התמיסה בטמפרטורה של 37 °C למשך שלוש שעות כדי לקבל גרעין מיקרוטובולי או MT nucleus יציב.

לאחר מכן, ערבבו 950 µL של תמיסת הטוביולין ו-50 µL של תמיסת הטוביולין המכילה GpCpp. לאחר מכן, הניחו לתמיסה למשך יום אחד בטמפרטורה של כ-25 °C כדי לקבל תמיסת MT יציבה בריכוז של 0.5% משקל. לאחר מכן, הכינו תמיסת DNA בריכוז של 0.5% משקל ותמיסת בופר Tris-EDTA.

שמר את תמיסות הדגימה של הביופולימר בריכוז של 0.5 אחוזי משקל בטמפרטורה של 25 degrees celsius עבור ניסוי הייבוש. גזור גיליון סיליקון לצורה מתאימה בעובי של 1 millimeter. הרכב תא פתוח מצד אחד המורכב ממפריד הסיליקון ושתי סלייד זכוכית ללא טיפול.

קבעו את שני צדדי התא באמצעות תפסים כפולים כדי למנוע דליפה של תמיסות הדגימה. בעזרת טיפ פיפט עם גודל נקבים של מילימטר אחד, הוסיפו באיטיות 100 עד 300 µL מכל תמיסת ביופולימר בריכוז 0.5 weight percent לכל תא, בטמפרטורה של כ-25 °C. הסירו בועות אוויר מהתא באמצעות מחט של מזרק.

בשלב הבא, מקמו את התאים בתנור עם סירקולטור אוויר למשך 18 שעות בטמפרטורה של 60 degrees celsius תחת לחץ אטמוספרי לצורך אידוי. כיוון הפעולה הוא הפוך לכיוון כוח הכבידה. מיקום זה ייתכן גם עבור הניטור לבדיקות מאוחרות יותר.

השתמשו במנורת הלוגן של 100 watt עם מקור אור בעל פני שטח שטוחות המכסה שטח רחב כדי לספק אור נראה ישר. כוונו את המקטבים ל-45 מעלות ו-135 מעלות באמצעות התושבות. קבעו את המיקומים של מקור האור, המקטבים, במת השמיקה והמצלמה באמצעות מסילה אופטית ומערכת מוטות.

הניחו את במת הדגימה בין שני המקטבים. לאחר מכן, מקמו את המצלמה במרחק של כ-20 סנטימטרים מבמת הדגימה כדי לאפשר מיקוד. בזמנים המצוינים בפרוטוקול הכתוב, הניחו את דגימות הביופולימר בין המקטבים על הבמה במקביל למישור XZ וכסו את המכשיר בכיסוי שחור.

לבסוף, צלם את הדגימות באמצעות מקטבים ליניאריים מצולבים בעזרת מצלמה דיגיטלית מסוג SLR עם עדשת זום סטנדרטית. הוערכה האינטגרציה העצמית ממיקרו-דומיין למאקרו-דומיין בממשק אוויר-LC במצב ייבוש. לפני הייבוש, נצפו אזורים בהירים עם אור חולף במצב מפוזר.

לאחר הייבוש, האזור שמתחת לממשק האוויר-LC והתמיסה של הסאקראן הפכו לגבוהים, ועוצמת תמיסת הקסנתין פחתה עם מקרו-דומיינים קטנים. ניתוח מרחבי-זמני הראה כי שיאו של העוצמה סביב ממשק האוויר-נוזל והעובי עלו, מה שמעיד על כך שהמיקרו-דומיינים מתחילים להתorient מממשק האוויר-LC וגדלים לדומיין בקנה מידה של מילי-מטר המקביל לממשק. תמונות מיקרוסקופיות פולריזציוניות של פאזת הנוזל של הסאקראן הראו אזור כחול אחד, שפירושו הוא שנוצר מקרו-דומיין יחיד.

הפאזה הנוזלית של גוממי קסנתן הראתה אזורים כחולים, צהובים וורודים, מה שמעיד על כך שמספר מקרו-דומיינים (macrodomains) נוצרו באוריינטציות שרירותיות. לפני הייבוש, תמיסאות הסאקראן (sacran) וה-MT הראו מצבי LC דומים עם דומיינים מפוזרים. במהלך הייבוש, תמיסאת ה-MT עברה אינטגרציה עצמית והדומיינים המפוזרים התמזגו למקרו-דומיין יחיד.

תמיסת ה-DNA לא הראתה אוריינטציה ספציפית בשלב הנוזלי. רשומת הייבוש של ה-sacran הראתה דו-שבירה (birefringence) משמעותית, ובתוך רשומת הייבוש של ה-MT נצפו צרורים גליים. רשומת הייבוש של ה-DNA הראתה מקרו-דומיינים בעלי צורת גרגיר בכיוונים שרירותיים.

לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום ההנדסה ביו-רפואית המשתמשים בביופולימרים לחקור ויזואליזציה של דינמיקת זרמי אוויר בתהליכי ייבוש והרטבה בגישות גיאומטריות.