ליפיד הפקת וניתוח שיטה לאפיון קרקע חיידקים בניסויים עם דוגמאות רבות

מטרת סרטון זה היא לתאר שיטה המגדילה את התפוקה תוך איזון מאמץ ודיוק למיצוי שומנים מממברנות התאים של מיקרואורגניזמים לשימוש באפיון הן סך השומנים והן השפע היחסי של שומנים אינדיקטורים לקביעת מבנה הקהילה המיקרוביאלית בקרקע ומחקרים עם דגימות רבות. בשטח, עליך לקחת בחשבון את ההטרוגניות של הקרקע באיסוף דגימות קרקע באופן שייצג את האתר שלך. כדי לשמר את הקהילה המיקרוביאלית בזמן הדגימה, יש להעביר דגימות מהשדה על קרח.

לאחר החזרה למעבדה, הסר שורשים ואבנים ושבר גושים על ידי סינון גס. זה משמש גם להומוגניזציה של הדגימה שלך. התכוננו לייבוש בהקפאה על ידי הכנסת דגימות משנה למיכלים מתאימים וייבשו בהקפאה בהקדם האפשרי.

לאחר ייבוש הקרקעות בהקפאה, יש לאחסן בכלי אטום עם חומר ייבוש עד למיצוי. עדיף לאחסן קרקעות מיובשות במקפיא בטמפרטורה של 80 מעלות C.As הכנה למיצוי להוציא קרקעות מיובשות בהקפאה מהאחסון ולטחון. שיטות הטחינה כוללות טחנת כדור, מד כדור או מרגמה ועלי.

לאחר טחינת האדמה, שוב, הומוגניזציה של דגימות האדמה שלך ביסודיות ואחסן במקפיא. כל כלי המעבדה חייבים להיות נקיים בקפידה. כל שאריות חומר ניקוי, שומן או לכלוך יכולים להשפיע על התוצאות על ידי הופעה כשיא בכרומטוגרמה הסופית של GC.

המיצוי מתבצע בצינורות צנטריפוגה טפלון בנפח 30 מיליליטר, אותם יש לשטוף בממס. הוסף שניים עד שלושה מיליליטר הקסאן לצינורות ומערבולת למשך מספר שניות. שפכו את ההקסאן לצינור ומערבולת אחרים.

ניתן להשתמש בשניים עד שלושה מיליליטר הקסאן לשטיפה סדרתית של שישה צינורות. אחסן צינורות שטופים בהקסאן הפוך במכסה האדים והשליך את ההקסאן המשומש למיכל פסולת מתאים. ניתן לעמעם או לשטוף כלי זכוכית עם ממס מיד לפני השימוש.

עמעם מבטיח שכלי הזכוכית נקיים על ידי חמצון של שאריות בטמפרטורה גבוהה. עוטפים את כלי הזכוכית בשתיים עד שלוש שכבות של נייר אלומיניום ומכניסים לתנור המופל. הגדר ל -450 מעלות צלזיוס, ולאחר שהתנור הגיע לנקודת ההגדרה אופים לפחות 4 1/2 שעות.

אפשר לפחות שעה לקירור לפני הוצאתו מהתנור. סמן ושקול צינורות טפלון שטופים הקסאן. הוסף אדמה לצינורות צנטריפוגה טפלון ושקול מחדש למסת האדמה.

הכינו תמיד לפחות שני ריקים לכל אצווה וכללו תקן בדיקה, רצוי אדמה שחולצה בעבר, אם ברצונכם לוודא שהמיצוי עבד כהלכה. מיצוי שומנים. הכן שלוש פיפטות חוזרות של חמישה עד 10 מיליליטר עבור מאגר פוספט, כלורופורם ומתנול.

כלורופורם הוא נוזל צפוף מאוד בעל מתח פנים נמוך. היזהר שהכמות שאתה מחלק תהיה מדויקת ועקבית. שמור את הבקבוק לפחות חצי מלא בנוזלים.

במכסה האדים, הוסף את הריאגנטים לאדמה בצינור הטפלון בסדר הבא, מאגר פוספט, כלורופורם ומתנול. זוהי המיצוי הפיזי הראשון של שומנים מחומר הדגימה שלך. המתכונים לפתרונות ריאגנטים כלולים בפרוטוקול הכתוב.

פרופורציות הממס וסדר ההוספה חשובים להפרדה נכונה של השלבים האורגניים והמימיים. אפשר לקרקעות זמן להירטב לאחר הוספת החיץ לפני הוספת הכלורופורם. במידת הצורך, ניתן לשלב את חומרי המיצוי ולהוסיף אותם כמנה אחת עבור העקירה השנייה וכל העקירה הבאה.

מכסים היטב את צינורות הטפלון ומכסים כדי להגן מפני אור. הנח אותם על השייקר בצורה אופקית וודא שהם מאובטחים היטב. עם הגדרת מהירות גבוהה, יש לנער לשעה אחת.

בזמן שהצינורות רועדים, הכינו שני צינורות זכוכית ארוכים לכל דגימה כדלקמן. סמן את הצינור, הוסף את אותו נפח של כלורופורם שנוסף לאדמה ונפח שווה של מאגר פוספט. לאחר הוצאת צינורות הטפלון מהשייקר בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס צנטריפוגה את הצינורות למשך 10 דקות ב-2,500 סל"ד.

ואז, במכסה האדים כשהאורות כבויים, שפכו את הסופרנטנט מצינור הטפלון לתוך אחד הצינורות הארוכים. הפרדת פאזות צריכה להיות גלויה בצינור הזכוכית. השכבה התחתונה מכילה את הממס האורגני, בעיקר כלורופורם, ואת השומנים.

מיצוי זה חוזר על עצמו. שופכים את הסופרנטנט לצינור השני שהוכן קודם לכן. עכשיו הוצאת פיזית את השומנים מהאדמה פעמיים.

עבור רוב הקרקעות, זה מספיק. מכסים היטב את כל הצינורות הארוכים עם מכסים מרופדים בטפלון והופכים 10 פעמים לערבוב. הפרד שלבים לפי כוח הכבידה בן לילה.

אפשר לדגימות לעמוד ללא הפרעה למשך הלילה כדי להשלים את ההפרדה של שני השלבים. לשם כך, שמור את הדגימות בארון חשוך או מכוסה בנייר אלומיניום בטמפרטורת החדר. זה בסדר לאפשר לתמציות להיפרד במהלך סוף השבוע.

היום השני, בידוד השומנים. ביום השני, השכבה המימית נשאבת והשומנים מרוכזים על ידי הסרת הממס במערכת אידוי ואקום. ניתן לייבש את הדגימות גם על ידי הנחתן באמבט מים או חול ומריחת זרם עדין של חנקן.

הנוזל בצינורות צריך להיות מופרד היטב וצלול במידה רבה. אם לא, או אם הממשק בין שתי השכבות עבה במיוחד, אפשר להפרדה להימשך עוד יום. הגדר שואב ואקום במכסה המנוע.

זהו בקבוק זרוע צדדי המחובר למשאבת ואקום עם צינור טיגון עלים ופיפטת מרעה. כשהמשאבה פועלת, השתמש בפיפטה כדי למשוך את השלב המימי לתוך הבקבוק. שאפו את השכבה העליונה ואת הממשק.

זה יהיה בערך 2/3 מהדרך למטה. עשה זאת לשניים עד שלושה סטים של צינורות זכוכית. השכבה העליונה עשויה להכיל כמה חלקיקי אדמה.

הסר אותם במידת האפשר. שלב את התמצית ממערכת הצינורות השנייה או השלישית עם זו שבשניים הראשונים על ידי סילוק בזהירות. נסה לא לכלול יציקת חומר מוצק כלשהו ולשטוף את קירות הצינור על ידי סיבוב.

השתמש בפיפטה נקייה עבור כל דגימה וחזור על תהליך זה עבור הדגימות הנותרות. לאחר שתמציות הכלורופורם שולבו וישבו מספר דקות, בדוק את פני הנוזל. לעתים קרובות תיווצר שכבה דקה של שאריות מים.

אם זה קיים, שאפו לפני שתמשיכו. שאריות מים עשויות לתקוף קשרים כפולים של חומצות שומן, אך כמות קטנה מאוד אמורה להתאדות יחד עם הממיסים עם ייבוש הדגימות. יבש את כל הדגימות באמצעות מכשיר אידוי הוואקום.

מכסים היטב את הצינורות ושומרים במקפיא בחום של 80 מעלות צלזיוס.יום שלישי, ספוניפיקציה ומתילציה. ראשית, הפעל את אמבטיות המים. בדוק את מפלס המים והגדר את האמבטיה אחת עד 95 מעלות צלזיוס ואמבטיה שתיים עד 80 מעלות צלזיוס.בעזרת פיפטה מחדש, הוסף מיליליטר אחד של מגיב הסבוניפיקציה, מגיב 1, לשומנים המיובשים.

מכסים היטב, מערבולת קצרה ומניחים על רשת. לאחר השלב הזה, הכניסו את מתלה הצינורות לאמבט המים של 95 מעלות צלזיוס והמתינו חמש דקות. הסר את מתלה הצינורות מהאמבטיה ובדוק אם יש נזילות בצינורות.

זה יצוין על ידי בועות העולות בצינור כמו קצף. הדק מחדש או החלף את מכסי הצינורות הדולפים. המשיכו לחמם את הצינורות באמבט המים למשך 10 דקות נוספות.

הפחיתו את הגדרת הטמפרטורה באמבט המים ל 80 מעלות צלזיוס והמשיכו בדגירה למשך 15 דקות נוספות. הסר את הצינורות ומצנן על ידי הנחת המתלה לתבנית מי ברז. אין להשתמש במי קרח.

לאחר שהדגימות התקררו, הוסף שני מיליליטר של מגיב המתילציה, מגיב 2, לכל דגימה. שוב, מכסה היטב ומערבולת למשך חמש עד 10 שניות. מלחים גרגירים עשויים להיראות כמשקעים בתמיסה, מה שקורה לפעמים בגלל עודף ריאגנטים.

הכניסו את המתלה לאמבט המים של 80 מעלות צלזיוס ודגרו למשך 10 דקות. הסר את מתלה הצינורות מאמבט המים והכניס אותו לתבנית מי ברז לקירור. מערבבים את המתלה כדי להאיץ את תהליך הקירור.

בעזרת פיפטה מחדש, הוסף 1.25 מיליליטר אחד של אתר בוטיל הקסאן ומתיל שלישוני, מגיב 3, לכל צינור כדי לחלץ את השלב. אוטמים היטב את הכובעים ומניחים את הצינורות על שייקר למשך 10 דקות. לאחר הטלטול, הניחו למתלה הצינורות לשבת במשך 10 דקות עד שהשלבים ייפרדו.

מעבירים את השלב האורגני, שהוא כעת השכבה העליונה, לצינור זכוכית קצר באמצעות פיפטת מרעה. עדיף להחזיר את רוב הנוזל. כמויות קטנות מאוד של הפאזה המימית לא יפגעו במיצוי

חזור על מיצוי פאזה מימית על ידי הוספת מגיב 3, ניעור, מתן אפשרות לשלבים להפריד והעברת השלב העליון. בהתאם למצב השלב התחתון, באפשרותך לחזור על פעולה זו פעם נוספת למשך שלוש העברות בסך הכל. הוסף 3 מיליליטר משטיפת הבסיס, מגיב 4, שהוא תמיסה מדוללת של נתרן הידרוקסיד, לתמציות בצינורות הקצרים.

מכסים היטב את המבחנות ומערבולת למשך 20 עד 30 שניות ולאחר מכן צנטריפוגה למשך שלוש דקות במהירות של 2,000 סל"ד. לאחר הצנטריפוגה, בעזרת פיפטת מרעה נקייה שואבים את השלב האורגני העליון ומעבירים לבקבוקון ענבר של ארבעה מיליליטר. היזהר מאוד לא לשאוף אף אחד מהשלב הימי.

השלב הבא הוא אידוי הממס ליובש במנגנון אידוי ואקום. היום הרביעי, הכנת התמציות לניתוח GC. בעזרת הצינור, הוסף 100 מיקרוליטר של ריאגנט 3 לכל אחד מבקבוקוני 4 מיליליטר המכילים את השלב המיובש.

מערבל את הדגימה ואז אפשר לה לעמוד במשך 10 דקות. בעזרת הצינור השני, העבירו בזהירות את ה-FAMEs התלויים לבקבוקון GC. הוסף עוד מנה של הממס לבקבוקון של ארבעה מיליליטר ולמערבולת בקצרה.

גלגל את הבקבוקון כדי להבטיח ששאריות ה-FAMEs על קירות הבקבוקון מומסות. בעזרת המקטרת השנייה שוב, העבירו את הממס לבקבוקון ה- GC. השלם את ההעברה על ידי הוספת מנה שלישית של ממס לבקבוקון, מערבולת והעברה לבקבוקון ה-GC.

מכסים את בקבוקון ה-GC ושומרים במקפיא. אחסן בקבוקוני GC אטומים במקפיא לפני הניתוח. ניתוח GC.

כדי להשתמש במערכת זו, יש לבצע את הניתוח באמצעות עמודת GC ספציפית. כרומטוגרף הגז מצויד בכניסה מפוצלת ללא פיצול המצוידת בתוחם כניסת זכוכית ID של ארבעה מילימטר עם פקק צמר זכוכית מנוטרל. הכניסה מוגדרת ל -250 מעלות צלזיוס ומופעלת במצב לחץ קבוע.

הגז הנשא הוא מימן. חנקן ואוויר נחוצים כגזים תומכים בגלאי. נעשה שימוש בעמודת Agilent Ultra 2.

אורך העמוד 25 מטר עם קוטר פנימי של 2 מילימטר ועובי סרט פאזה נייח של 33 מיקרומטר. השלב הנייח בעמודה זו הוא 5% פניל, 95% מתילפוליסילוקסן, הידוע גם כעמודה מסוג DB-5. כדי לנתח את תמציות השומנים, מוזרק אליקוט של שני מיקרוליטר ביחס מפוצל של 100:1 עם טמפרטורת התנור C.Post 170 מעלות בהזרקה, התנור מתוכנת לעלות בחמש מעלות לדקה עד 300 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להחזיק למשך 12 דקות.

סדרה של זריקות בתקן MIDI מתבצעת והתוצאות משמשות לביצוע התאמות בהתאם להוראות במדריך MIDI. לאחר כיול בדרך זו, המערכת עשויה להזדקק להתאמות קלות מדי פעם, אך בדרך כלל אמורה להשיג תוצאות טובות באמצעות פרמטרים אלה. מערכת ה-MIDI מפיקה דוח עבור כל דגימה המכילה טבלה עם שורה אחת לכל שיא ממומש.

התוכנה מדווחת על זמן שימור שיא, אזור שיא, זיהוי שיא, יחד עם ECL או אורך שרשרת משוער, פרמטר המשמש לזיהוי שיא, וגורם תגובה, פרמטר המשמש לנורמליזציה של וריאציות ותגובת גלאי ביחס לזמן השמירה. ה-ECL מבטא היכן מבין סדרה של תהילות שרשרת ישרות כל FAME לא ידוע מוציא. כך למשל, אם זמן השמירה של לא ידוע נפלט באמצע הדרך בין אלה של שרשרת פחמן 12 ו-13, ה-ECL מדווח כשרשרת פחמן של 12.5.

התוכנה משווה את ה-ECL של כל שיא לאלה של FAMEs במסד נתונים, והיכן שמתרחשות התאמות מקצה את השם המתאים ללא-ידוע. במקרים שבהם לשני FAMEs במסד הנתונים יש ECL קרובים מאוד, התוכנה מדווחת על שני השמות המציינים את הקרובים ביותר. ניתן לאסוף את טבלאות הנתונים מהדוחות לגיליון אלקטרוני או למסד נתונים.

לאחר התאמה לגורם התגובה, ניתן להשוות את אזורי השיא לאזור השיא של תקן חיצוני או פנימי כדי להגיע לריכוז התמצית. על ידי חלוקת מסת האדמה המופקת, ניתן לבטא את הנתונים כמסה של FAME לגרם אדמה או, על ידי שימוש גם במשקל המולקולרי של כל FAME, כננומול לגרם אדמה. לאחר מכן ניתן לסכם FAMEs של סמנים ביולוגיים כדי להניב ביומסה של גילדות מיקרוביאליות, וניתן לנתח את הגילדות הללו עוד יותר.

לדוגמה, כאן אנו רואים ערבות לא מופרות עם יותר ביומסה של FAME מאשר ערבות מופרות. לשניהם יש יותר ביומסה מאשר לשדות תירס סמוכים. כמו כן, FAMEs קשורים לקבוצות פונקציונליות מסוימות כמו פטריות או חיידקים.

אסוציאציות אלה הן ספציפיות למערכת האקולוגית, ולכן חשוב לא להכליל אותן יתר על המידה. סוג זה של ניתוח מראה אם קבוצות מסוימות נפוצות יותר בסביבות מסוימות. כאן, פטריות נפוצות יותר בערבה הלא מופרית מאשר בשדה התירס.

ולבסוף, דרך נוספת להסתכל על ההרכב הכולל של קהילת המיקרואורגניזמים היא להשוות על ידי התבוננות בשכיחות היחסית של כל FAMEs בבת אחת באמצעות שיטות הסמכה כמו קנה מידה רב-ממדי לא מטרי, NMDS, או ניתוח רכיבים עיקריים, PCA. בהסמכה, קהילות מיקרוביאליות דומות יותר יהיו קרובות יותר זו לזו. אם כן, מנתוני הדוגמה שלנו, תירס וערבה לא מופרית רחוקים מאוד זה מזה, בעוד שלחלק מדגימות הערבה המופרית יש חברות מיקרוביאליות שדומות לאלה של תירס, ואחרות דומות לערבה הלא מופרית.

קהילות מיקרוביות לעיתים קרובות משתנות מאוד אפילו בתוך סביבה, כך שהן לא תמיד ייפרדו בצורה מסודרת. לאחר צפייה בסרטון זה, אדם אמור להבין היטב את התהליך שבו סמנים ביולוגיים של שומנים מממברנות התאים של מיקרואורגניזמים מופקים מהאדמה. מיצוי חומצות שומן פוספוליפידים הוא דרך יעילה, מהירה וזולה להעריך גילדות מיקרוביאליות וביומסה מיקרוביאלית כוללת באמצעות זיהוי סמנים ביולוגיים מיקרוביאליים ייחודיים.