פלטפורמת Microarray Cell תפוקה גבוהה עבור ניתוח גומל של התמיינות תאי כוחות המתיחה

המטרה הכוללת של פלטפורמת מיקרו-מערך תאים זו היא לתאם מדידות הן של התמיינות התאים והן של כוחות המתיחה כפונקציה של הקשר מיקרו-סביבתי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנדסת הרקמות, ומאפשרת הן חקירות בסיסיות של ביולוגיה של תאי גזע והן אופטימיזציה של פרוטוקולי התמיינות. היתרונות העיקריים של טכניקה זו כוללים את התפוקה שלה, היכולת לשנות רמזים ביוכימיים וביופיזיים, וקריאות נקודות קצה הן על ידי אימונופלורסנט והן על ידי מיקרוסקופ כוח משיכה, או TFM.

למרות שהשתמשו בשיטות אלה, אלה שמבינים את התמיינות אבות הכבד ניתן ליישם אותה בקלות על סוגי תאי עורקים אחרים והקשרי רקמות. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן הצלחת הניסוי תלויה בשילוב פרוטוקול המערך הן עם מצעי הידרוג'ל איכותיים והן עם מיקרוסקופ כוח משיכה. כדי לייצר חרוז פלואורסצנטי המכיל הידרוג'לים פוליאקרילאמיד על צלחת פטרי עם תחתית זכוכית 35 מ"מ סילנית להערכה חיה של אינטראקציות מצע תאים באמצעות TFM, ראשית, הכינו מצעי זכוכית בתמיסות כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

מניחים צלחות פטרי תחתונות זכוכית 35 מ"מ בסילאן לתוך מגש ייבוש זכוכית ופיפטה 20 מיקרוליטר של חרוז קדם-פולימרי 9 ל-1 לתמיסת יוזם צילום על מרכז כל צלחת. מכסים בעדינות כל צלחת בגלישת כיסוי עגולה של 12 מ"מ תוך הימנעות מיצירת בועות. על מנת להפיץ את חרוזי הפלואורסצנט על פני ההידרוג'ל, הפכו את הכלים והשאירו אותם בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.

בעודו הפוך, חשוף את המנה ל-UVA של 365 ננומטר למשך 10 דקות. ייעל את זמן הפילמור לפי הצורך. לאחר מכן, טבלו את ההידרוג'לים במאגר HEPES מולארי אחד והשאירו אותם בטמפרטורת החדר בחושך למשך הלילה.

הסר את החלקות הכיסוי בזהירות בעזרת סכין גילוח, והקפיד לא לפגוע בהידרוג'לים הפולימריים. יבשו את ההידרוג'לים בחום של 50 מעלות צלזיוס על פלטה חמה עד לייבוש. ניתן לאחסן הידרוג'לים בטמפרטורת החדר בחושך למשך שלושה חודשים.

הכן מאגרים להדפסת הביו-מולקולות וללוחית המקור כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר טעינת הפינים הנקיים כמתואר בפרוטוקול הטקסט, הכן את המיקרו-מערך ותכנת אותו באמצעות תוכנת היצרן. לאחר מכן, הפעל את יחידת האדים.

כוונן את נקודת ההגדרה ל-65% לחות יחסית והמתן עד שהריאומטר יתאים לנקודת ההגדרה. הנח את לוחית המקור במתאם המתאים. לאחר מכן הנח את מצעי ההידרוג'ל המיובשים במתאם המתאים.

התאם את הפרמטרים של התוכנית כדי לשקף במדויק את הפריסה של לוחית המקור, עיצוב המערך והפורמט הרצוי. התחל בייצור המערך. בדוק לא פחות מפעם בשעה שהלחות לא ירדה מתחת ל-65% לחות יחסית ושהפינים אינם סתומים.

אם הלחות ירדה באופן בלתי צפוי, השהה את המערך כדי למלא את מכשיר האדים ולנקות את צינורות העיבוי הנלווים. אם הפינים סתומים, השהה את המערך כדי לנקות את הפינים או החלף אחרת בפינים שנקו מראש. לאחר השלמת התוכנית, הנח מערכים מפוברקים בקופסת שקופיות או בצלחת מיקרו מכוסה בנייר אלומיניום.

השאירו את המערכים בטמפרטורת החדר ב-65% לחות יחסית למשך הלילה. מניסיוננו, הקשיים הנפוצים ביותר קשורים לייצור מערכים. אנו ממליצים לאשר את האיכות הטכנית והחוסן של מערכים מיוצרים באמצעות מולקולות עם תווית פלורסנטית, כתמי חלבון כלליים ואימונופלורסנט .

יום לאחר הייצור, טבלו את המערך של צלחות פטרי 35 מ"מ ב-3 מ"ל של 1% נפח לנפח פניצילין-סטרפטומיצין ב-PVS. חשוף את המצעים המסודרים ב-UVC למשך 30 דקות. לאחר מכן החלף את תמיסת הפניצילין-סטרפטומיצין במצע תרבית תאים.

לאחר איסוף וספירת התאים, זרעו את התאים על מערכים ב-3 מ"ל לכל צלחת פטרי של 35 מ"מ. דגרו על תרביות המערך בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך שעתיים עד 24 שעות, או עד להיווצרות איי תאים מאוכלסים היטב. ניתן להתאים את צפיפות הזריעה וזמן הזריעה בהתאם לתאים וליישום מסוים.

לאחר שאפשרת היווצרות איי תאים, שטפו את תרביות המערך פעמיים עם 3 מ"ל של מצע תרבית תאים מחומם מראש. בשלב זה, ניתן להוסיף את הבקרות והטיפולים המתאימים למערכת הביולוגית. החלף את המדיה של המערכים כל יום עד יומיים כדי לשמור על הריכוז של כל הטיפולים.

תוך יום עד חמישה ימים מהתחלת תרביות מערך, בצע הערכה חיה של אינטראקציות מצע התא באמצעות TFM. העבר את צלחות הפטרי בגודל 35 מ"מ המכילות תרביות מערך למיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך מודגר עם במה רובוטית למדידות TFM. בצלחת אחת, סמן את המיקומים ומישורי המיקוד של איי תאים בודדים באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה.

עבור למיקרוסקופ פלואורסצנטי אדום רחוק כדי לדמיין את החרוזים. לאחר מכן חזור לכל אחד מהמיקומים שנשמרו בשלב הקודם ותקן את קואורדינטות ה-z של מישור המיקוד, כך שרק שכבת החרוזים הראשונה מתחת לאי התא תהיה בפוקוס. שמור את הקואורדינטות החדשות והמשך להדמיה אוטומטית של כל איי התא כדי ללכוד את ניגודיות הפאזה שלפני הדיסוציאציה ותמונות פלואורסצנטיות אדומות רחוקות.

לאחר מכן, הוסיפו בזהירות 150 מיקרוליטר של תמיסת BSA/SDS לתבשיל והמתינו חמש דקות כדי לאפשר ניתוק מוחלט של התאים מהמצע. עקוב אחר דיסוציאציה של תאים באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. לאחר ניתוק איי התא מהמצע, חזור למיקומים המסומנים ובדוק ששכבת החרוזים הראשונה עדיין בפוקוס.

אם חרוזים אלה אינם במישור עקב עיוות הנגרם על ידי מתיחה שנוצרה על ידי תאים, תקן את קואורדינטות ה- z של המישור הממוקד כך שיהיו שוב בפוקוס. שמור את קואורדינטות ה-z המתוקנות וחזור על הדמיה אוטומטית של כל האיים כדי ללכוד את התמונות הפלואורסצנטיות האדומות הרחוקות שלאחר הדיסוציאציה. חזור על שלבים אלה עבור שאר הכלים.

ליגנדים מחורצים מצומדים של חלבון A/G משוננים אחד ודלתא כמו אחד הראו שימור משופר בהידרוג'לים. הצגת ליגנד החריץ הניעה גם את ההתמיינות של אבות הכבד לעבר גורל תאי צינור המרה כפי שמצוין על ידי נוכחות סמן תאי צינור המרה הירוק. התגובה לליגנדים חריצים כומתה עבור חמישה חלבוני מטריצה חוץ-תאית, או ECM, והראתה כי התגובה של אבות הכבד לליגנדים תלויה בהקשר של ECM.

נוקדאון RNA סיכת ראש קטנה שימש ליצירת אבות ללא דלתא הליגנדים כמו אחד ואחד משונן. לאחר מכן הוצגו לתאים ליגנדים מחורצים משוננים אחד ודלתא כמו אחד ודלתא כמו ארבע. התגובה לליגנד החריץ המערך השתנתה בהתאם לביטוי הפנימי של התא של כל אחד מהליגנדים.

תמונות אלה מראות את ההתמיינות של אבות הכבד כתלויה הן בנוקשות המצע והן בהרכב ה-ECM. ניתוח כמותי גילה כי קולגן 4 תומך בהתמיינות על מצעים רכים ונוקשים כאחד, בעוד שפיברונקטין תומך רק בהתמיינות על מצעים נוקשים. מפות חום מייצגות מצביעות על כך שמתח מתיחה מתמשך בקשיחות מצע נמוכה על קולגן ארבע מקדם התמיינות לתאי צינור המרה.

ממצא זה אושר על ידי כימות של ערכי שורש ממוצע ריבועי של מתח משיכה. סרטון זה והפרוטוקול הנלווה סיפקו את השלבים העיקריים לייצור הידרוג'לים ומערכים לביצוע תרבית תאים על המצעים המערכים ולמדידת אינטראקציות מצע תא באמצעות מיקרוסקופ כוח משיכה. לאחר היכרות עם הטכניקות, ניתן להשלים כל ניסוי תוך שבוע עד שבועיים אם הוא מבוצע כראוי.

בהתכווצות בשיטה זו, יש להשתמש בתרביות תאים כדי לאמת תנאי מערך בעלי ניקוד גבוה באמצעות PCR איכותי, כתמים חיסוניים, צירי מכניוביולוגיה בקנה מידה סטנדרטי או טכניקות ביולוגיה מולקולרית משלימות אחרות. ניתן ליישם פלטפורמה רב-תכליתית זו לקראת חקירת תפוקה גבוהה של תפקודי תאים במספר רחב של הקשרים של תאים ורקמות, כולל התמיינות תאי גזע וביולוגיה של תאי סרטן.