באמצעות שיטת הר שלמה Immunohistochemical ללמוד את שימור של דרכי המרה סונקוס מורן

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש בצביעה אימונוהיסטוכימית שלמה להדמיה של התפלגות העצבים בדרכי המרה של Suncus murinus. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לנתח את התפלגות העצבים של האיברים הקרביים של מינים רבים, במיוחד איברים לא סדירים או קטנים שקשה להעריך בשיטות סטנדרטיות. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהפעולה פשוטה.

זה לא דורש הליכים מסובכים ויש לו אחוזי הצלחה גבוהים. ידגימו איתי את ההליך יידאן דאי, סטודנט לתואר שני, ושואנג-צ'ין יי, עמית מחקר, שניהם מהמעבדה שלי. התחל בשטיפת החיה עם PBS בודד ו-4% פרפורמלדהיד זלוף בארון אדים.

לאחר מכן הזריק שניים עד שלושה מיליליטר של לטקס ניאופרן לבן דרך צנתר הזלוף לתוך אבי העורקים הבטני כדי לסמן את כלי הדם. וכאשר כל הרקמות המעניינות סומנו, הוציאו את איברי הבטן ואת העצבים וכלי הדם הקשורים אליהם. לאחר מכן יש להזריק כ-0.1 מיליליטר של לטקס ניאופרן כחול לכיס המרה כדי לסמן את מערכת המרה ולאחר מכן לתקן את הרקמות ב-4% פרפורמלדהיד למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס לצביעה חיסונית שלמה.

למחרת בבוקר, העבירו את הדגימה לבקבוקון זכוכית לארבע שטיפות בטמפרטורת החדר של שעה במים מזוקקים על נום. לאחר הכביסה האחרונה, דגרו את הרקמות בחומצה אורתופריודית 1% שהוכנה טרייה למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי למנוע תגובות פרוקסידאז מהותיות. לאחר מכן, שטפו את הדגימה במים מזוקקים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן דגירה בפפיון טרי של 0.004% למשך שעתיים באמבט מים בטמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס עם נדנדה עדינה.

בתום הדגירה יש לשטוף את הדגימה במים מזוקקים למשך 50 עד 60 דקות. לאחר מכן אחסן את הרקמות ב-4% פרפורמלדהיד בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת בבוקר, שטפו את הדגימה במים מזוקקים כפי שהודגם זה עתה ואחריה דגירה נוספת של שעתיים בפפיון טרי.

שטפו את הדגימה למשך 50 עד 60 דקות נוספות במים מזוקקים, ולאחר מכן קיבוע למשך הלילה ב-4% פרפורמלדהיד. בבוקר השלישי, שטפו את הטישו ארבע פעמים במים מזוקקים, ולאחר מכן טבילה בשלוש דגירות סוכרוז עולות ברצף של 30 דקות. לאחר מכן הקפיאו את הדגימה במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 60 דקות, ולאחר מכן הפשרה מלאה בטמפרטורת החדר.

לאחר מחזור ההקפאה-הפשרה השלישי, העבירו את הדגימה ל-2% Triton X-100 לדגירה של ארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת בבוקר, העבירו את הדגימה למיכל של הנוגדן העיקרי המעניין לנדנוד עדין על הנוטרטור בארבע מעלות צלזיוס למשך שלושה עד שישה ימים בהתאם לגודל הדגימה. לאחר תקופת התיוג המתאימה, הסר את הנוגדן הראשוני הלא קשור בארבע שטיפות של שעה ב-PBS בטמפרטורת החדר וסמן את הדגימה בנוגדנים המשניים המתאימים למשך שלושה ימים עם נדנוד עדין בארבע מעלות צלזיוס.

בתום תקופת תיוג הנוגדנים המשנית, שטפו את הדגימה ארבע פעמים ב-PBS. לאחר מכן דגרו את הרקמות ב-10 מיקרוליטר של מי חמצן 30% ב-100 מיליליטר של תמיסת צביעה טרייה של 0.002% DAB בארבע מעלות צלזיוס למשך 16 עד 72 שעות עם נדנוד עדין. כאשר הושגה עוצמת הצביעה האופטימלית, העבירו את הדגימה ל-0.04% נתרן אזיד ב-PBS כדי לעצור את תגובת הצביעה.

לאחר מכן טבלו בזהירות את הדגימה בצלחת פטרי בגודל 10 סנטימטר המכילה PBS טרי וצלמו תמונות שלמות של הרקמות באמצעות מצלמה המותקנת על מיקרוסקופ סטריאו. בנוסף להדמיה של העצבוב של דרכי המרה החוץ-כבדיות, תיוג עם נוגדנים כנגד סיבי עצב חיוביים נוירופילמנט מאפשר גם זיהוי חד משמעי של צפיפות הריצה וההפצה של עצב הנרתיק לאורך הוושט ולתוך הקיבה. תיוג כלי הדם של כיס המרה בלטקס ניאופרן לבן חושף פיברוזיס עצבי דק בניגוד גבוה לרקמות הסובבות עם צפיפות עצבוב גבוהה יותר שנצפתה בצוואר כיס המרה מאשר בפונדוס.

בצינור המרה העליון מסומנים שני סוגים של צרורות עצבים, צרורות העצבים העדינים היוצרים רשת עצבים לא סדירה וצפופה ופועלים בדבק השוכנים על דרכי המרה ובתוכה והצרורות העצביים העבים יותר המופצים במקביל לפני השטח של דרכי המרה. תיוג צינור המרה המשותף עם לטקס ניאופרן כחול וכלי הדם עם לטקס ניאופרן לבן מאפשר הדמיה של סיבי העצב הדקים בקצה צינור המרה המשותף ואזור הפפילה התריסריון. לפני שתנסה הליך זה, הקפד לשחק את ציר הזמן של כל אחד מהניסויים מכיוון שהתהליך כולו דורש שבועיים-שלושה להשלמתו.

כדי למנוע פגיעה בדגימה בעת החלפת התמיסות, שפכו תמיד את התמיסות במקום להסיר את הדגימה בעזרת מלקחיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות מסוגל ליישם טכניקה זו על תיוג של מגוון עצבים בתוך איברים קרביים שונים.