איתור הביטוי microRNA בממברנה פריטוניאלית של חולדות באמצעות כמותי בזמן אמת PCR

המטרה הכוללת של הליך זה היא לטהר ולזהות בהצלחה miRNAs בקרום הצפק של החולדה. כדי להתחיל בהליך זה, לאחר הרדמה באינהלציה עם 4% איזופלורן. רססו את עור הבטן של החולדה באתנול 70% והרכיבו אותו על יריעת השעם, על גבה.

לאחר מכן בצע חתך אורכי בעור הבטן, השריר וקרום הצפק של החיה באמצעות מספריים ומלקחיים. הרם את קרום הצפק באמצעות המלקחיים ובצע חתכים אופקיים בחלקו העליון לאורך עצם הצלע התחתונה מתחת לסרעפת. ועל הצד התחתון שלו באזור הצדדי באמצעות המספריים הכירורגיים.

לאחר מכן, בצע חתכים אורכיים לרוחב כדי להסיר את קרום הצפק מהגוף, בעזרת המספריים הכירורגיים. ואז שוטפים אותו עם PPS בצלחת פטרי. גזרו וחתכו 20 מיליגרם של דגימת קרום הצפק.

בהליך זה, הנח דגימת ממברנה צפקית של 20 מיליגרם לתוך הומוגנייזר זכוכית. ולהוסיף 700 מיקרוליטר מגיב ליזה מבוסס פנול גואנידין. לאחר מכן, הומוגניזציה של דגימת הממברנה הצפקית על קרח, על ידי האטת לחיצת עלי על הדגימה עם פיתול.

חזור על תהליך זה כמה עשרות פעמים, עד שדגימת הממברנה הצפק התמוססה לחלוטין לתוך מגיב הליזיס המבוסס על פנול גואנידין. להומוגניזציה נוספת, העבירו את הליזט ההומוגני למערכת גריסה ביו-פולימרית בעמודת הספין של המיקרו צנטריפוגה בצינור איסוף של שני מיליליטר. ואז צנטריפוגה אותו ב -14, 000 פעמים G למשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, העבירו את הליזאט ההומוגני לצינור מיקרו צנטריפוגה חדש. הוסף 140 מיקרוליטר כלורופורם לליזט ההומוגני וכסה את הצינור היטב. לאחר מכן, מערבבים את הצינור בהיפוך למשך 15 שניות.

לאחר מכן, דגרו את הדגימה למשך שתיים-שלוש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, צנטריפוגה אותו ב-12,000 פעמים G למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. העבירו 300 מיקרוליטר של הסופרנטנט לצינור מיקרו צנטריפוגה חדש, מבלי להפריע למשקעים.

ולהוסיף 450 מיקרו ליטר של 100% אתנול. לאחר מכן מערבבים את הדגימה על ידי מערבולת למשך חמש שניות. לאחר מכן פיפטה עד 700 מיקרו ליטר מהדגימה לתוך עמוד ספין מבוסס קרום סיליקון, מונח בצינור איסוף של שני מיליליטר, וסגור את המכסה.

ואז צנטריפוגה אותו ב 15, 000 פעמים G למשך 15 שניות. לאחר הצנטריפוגה, השליכו את הזרימה בצינור האיסוף. לאחר מכן הוסף 700 מיקרוליטר של מאגר כביסה 1, לעמוד הסיבוב המבוסס על קרום הסיליקון כדי לשטוף בקפדנות את הדגימה ולסגור את המכסה.

צנטריפוגה אותו ב 15, 000 פעמים G למשך 15 שניות. לאחר הצנטריפוגה, השליכו את הזרימה בצינור האיסוף. הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה 2, לעמוד הסיבוב המבוסס על קרום הסיליקה, כדי להסיר כל זכר למלח, וסגור את המכסה.

ואז צנטריפוגה אותו ב 15, 000 פעמים G למשך 15 שניות. לאחר הצנטריפוגה, השליכו את הזרימה ואת צינור האיסוף וחזרו על הליך זה שוב. לאחר מכן, צנטריפוגה את עמודת הספין המבוססת על קרום הסיליקה שוב ב -15, 000 פעמים G למשך דקה אחת.

לאחר הצנטריפוגה, השליכו את צינור האיסוף וכל זרימה דרכו. הנח את עמוד הספין המבוסס על קרום הסיליקה בצינור איסוף חדש של נקודה וחמישה מיליליטר. לאחר מכן העבירו 25 מיקרוליטר מים ללא RNase על העמוד וסגרו את המכסה.

השאירו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. צנטריפוגה ב 15, 000 פעמים G למשך דקה אחת. לאחר מכן, העבירו את האלואט בנפח 25 מיקרוליטר המכיל את ה-RNA הכולל לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש ואחסנו אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס לפני השימוש.

בהליך זה, הכינו תמיסת תערובת מאסטר המכילה שני מיקרוליטרים של תערובת חומצות גרעין פי 10, שני מיקרוליטרים של תערובת טרנסקריפטאז הפוכה וארבעה מיקרוליטרים של מאגר Hispec פי 5, בסך הכל 8 מיקרוליטר לצינור. לאחר מכן הוציאו 8 מיקרוליטר מתמיסת תערובת המאסטר לכל צינור. מדוד את כמות ה-RNA הכולל באמצעות ספקטרופוטומטר.

לאחר מכן, הוסף מיקרוגרם אחד של סך ה-RNA המבודד, מטוהר מדגימת הממברנה הצפקית, לכל צינור. לאחר מכן, הוסף מים ללא RNase לכל צינור כדי להביא אותו לסך של 20 מיקרוליטר. לאחר מכן מערבבים אותו היטב על ידי פיפטינג וצנטריפוגה למשך 15 שניות.

לאחר מכן, דגרו את הדגימה למשך 60 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן דגרו אותו למשך חמש דקות בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס. העבירו את ה-cDNA החדש שנוצר לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש ודללו אותו 10 פעמים במים ללא RNase.

בהליך זה, הכינו תערובת מאסטר המכילה 12 נקודות חמישה מיקרוליטר של תערובת מאסטר 2x PCR, שני נקודה חמישה מיקרוליטרים של חמישה מיקרומולר של כל פריימר miRNA מומס במים נטולי נוקלאז, ונקודה אחת שניים חמישה מיקרוליטרים של פריימר אוניברסלי פי 10, לכל באר. מחלקים 22 נקודות חמישה מיקרוליטר מתערובת המאסטר הזו לכל באר של צלחת 96 בארות. לאחר מכן הוסף שניים וחמישה מיקרוליטרים של תבנית cDNA לכל באר.

אטום את צלחת התגובה של 96 באר בעזרת פיסת סרט. ואז צנטריפוגה אותו ב -1, 000 פעמים G למשך 30 שניות. כדי להפעיל את תוכנית האופניים PCR, הגדר את הצלחת במכשיר ה-PCR בזמן אמת.

בתוכנת PCR בזמן אמת, הגדירו את מאפייני הניסוי. לאחר מכן, הקצו שמות לדגימות והתמקדו ב-miRNA בכל באר. לאחר מכן, בזמן אמת תוכנת PCR הזינה נפח תגובה של 20 מיקרו ליטר ואת תנאי הרכיבה הבאים של PCR בהתאם להוראות.

דגירה מוקדמת בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. ואז 40 מחזורי דנטורציה ב-94 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, וכריעה ב-55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, והארכה ב-70 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. בהתבסס על miRNA, סינון מיקרו מערך, נמצא כי הרמות של שישה miRNAs מוגברות באופן משמעותי בקרום הצפק של חולדות פיברוזיס צפק, בהשוואה לאלו בחולדות מדומות וחולדות ביקורת, באמצעות QRTCPR, בהתאם לפרוטוקול המוצג בכתב יד זה.