הכנה במבחנה אפיון ממוגנטים miR-modified לתאי אנדותל
2 במאי 2017
כתב היד הזה מתאר את משלוח יעיל, שאינו ויראלי של miR לתאי אנדותל ידי וקטור PEI / MNP ו המגנטיזציה שלהם. לכן, בנוסף שינוי גנטי, גישה זו מאפשרת להדרכת תא מגנטית ויכולת גילוי MRI. הטכניקה יכולה לשמש כדי לשפר את המאפיינים של מוצרי תא טיפוליים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להציג טכניקה המבטיחה שינוי תאים עם מיקרו-RNA ובמגנטיזציה מקבילה של תאים. שיטה זו יכולה לתת מענה לאתגרים מרכזיים בתחום הרפואה הרגנרטיבית. כגון הנדסה גנטית של תאים לפני השתלה.
בנוסף לשינוי תאים יעיל עם מיקרו-רנ"א, הם אפשרו זאת עם תחמוצת ברזל. זה יכול לשמש לשיפור שימור התאים בצד העניין על ידי יישום שדה מגנטי. טיפול תאי מבטיח מאוד לטיפול במחלות לב, שימור תאי היפו ושיפור דחוף של הישרדות התאים.
התחל הליך זה עם תרבית תאי אנדותל וריד טבורי אנושי להכנת קומפלקסים של טרנספקציה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. 48 שעות לפני הטרנספקציה, זרע את ה-HUVECs על צלחות באר תרבית תאים מפלסטיק בגודל מתאים. עם צפיפות תאים התחלתית של כ-13,000 תאים לסנטימטר רבוע של משטח הגידול.
לאחר מכן, הכינו ננו-חלקיקי תחמוצת ברזל טריים miR/פוליאתילן/סופר פרמגנטי. ראשית יש לדלל 2.5 פיקומולים של מיקרו-RNA לסנטימטר רבוע של משטח גידול התא ותמיסת גלוקוז של חמישה אחוזים כדי לקבל ריכוז סופי של 0.125 פיקומולים של מיקרו-RNA למיקרוליטר. לאחר מכן, יש לדלל את ה- PEI בנפח שווה של תמיסת גלוקוז של חמישה אחוזים.
מוסיפים את ה-PEI המדולל לתמיסת המיקרו-RNA ומערבלים את התערובת המתקבלת למשך 30 שניות. לאחר מכן דגרו את תערובת miR/PEI למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. סוניקציה של ה-MNP למשך 20 דקות לפחות באמבט המים הסוניקטיבי בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן הוסיפו את הכמות המתאימה של תמיסת MNP לתערובת miR/PEI המוכנה. לאחר מערבולת של 30 שניות, יש לדגור למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו את תערובת ה-miR/PEI/MNP המוכנה ישירות למדיום התרבית שעל התאים.
החלף את התערובת הזו בתרבית טרייה בינונית שש שעות לאחר הטרנספקציה. לאחר ניתוח בטיחות הווקטור כמתואר בפרוטוקול הטקסט, אשר ואפיין את הלוקליזציה התוך-תאית של קומפלקסים טרנספקטיביים על ידי מיקרוסקופ תאורה מובנה קונפוקלי וסופר-רזולוציה. לשם כך, זרעו את ה-HUVECs על פתקי כיסוי זכוכית מצופים ג'לטין המונחים בבארות של צלחות תרבית של 24 בארות כמו קודם.
העבירו את התאים עם תווית miR/PEI/MNP ב-3 צבעים ודגרו במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה המכילה חמישה אחוזי פחמן דו חמצני. שטפו את החלקות הכיסוי תחילה עם שני אחוז אלבומין בסרום בקר ותמיסת מלח עם פוספט, ולאחר מכן עם PBS בלבד. תקן את התאים על ידי דגירה בארבעה אחוז פרפורמלדהיד או PFA ב -37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
שטפו עם PBS ולאחר מכן צבעו את הגרעינים ב-DAPI בהתאם לפרוטוקולים הסטנדרטיים. לאחר מכן שטפו את התאים עם PBS שלוש פעמים 15 דקות על השייקר כדי להסיר עודפי צבע. הנח את החלקות הכיסוי המוכנות על שקופיות מיקרוסקופ באמצעות אמצעי הרכבה מתאים ותן לשקופיות להתייבש לפחות שעה לפני השימוש בהן למיקרוסקופיה.
רכוש תמונות באמצעות מטרת טבילת שמן פי 63 בהגדרות ה-SIM שנמצאות בפרוטוקול הטקסט. עבור מיקוד תאים ותנאים דינמיים מדומים במבחנה, תחילה העבירו את ה-HUVECs לצלחת של 24 בארות כמו קודם. לאחר הדגירה למשך 24 שעות, יש לשטוף את התאים.
לאחר מכן הוסיפו x נסיעות אחד ב-EDTA מדולל ב-PBS ודגרו על התאים במשך ארבע דקות ב-37 מעלות צלזיוס לפני איסוף התאים. צנטריפוגה את התאים שנאספו ב -300 פעמים G למשך 10 דקות. מערבבים את כדור התא המתקבל מבאר אחת עם מיליליטר אחד של מדיום תרבית טרי.
ולהעביר את התאים לבאר אחת של צלחת של 12 בארות. תקן מגנט קטן באופן מקומי באמצעות סרט. הנח את לוחית התרבית על השייקר ודגר את מתלה התא למשך 12 שעות ב-150 סל"ד כדי לדמות תנאים דינמיים.
לאחר מכן שטפו את התאים וקבעו אותם באמצעות ארבעה אחוזי PFA. מכתים את הגרעינים ב- DAPI. הקלט את חיבור התא באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של סריקת לייזר עם לייזרי עירור של 405 ו-504 ננומטר במצב z-stack כדי להשיג את הנתונים הגולמיים.
השתמש בעיבוד תמונה של הקרנה בעוצמה מרבית כדי ליצור תמונות לניתוח. לניתוח כמותי של תאים בעלי תגובה מגנטית ולא מגיבים, תחילה העבירו את ה-HUVECs בצלחת של 24 בארות. דגרו על התאים במשך 24 שעות לפני שטיפה ואיסוף התאים כפי שתואר קודם.
השעו מחדש את כדור התא המתקבל מכל באר עם 500 מיקרוליטר של מאגר מיון תאים סטרילי מחומם. החל את מתלה התא על עמוד מיון מגנטי הקבוע על ידי המגנט המצורף. לאחר מכן שטפו את העמודים על המגנט שלוש פעמים עם מאגר מיון תאים טרי.
אסוף את הזרימה כשבר שאינו מגיב מגנטית. הסר את העמודות מהמגנט ואסוף מיד את חלק התא המגיב מגנטית על ידי דחיפה של מאגר מיון תאים טרי חשב העמודה באמצעות בוכנה. צנטריפוגה גם Mag-וגם Mag+fractions ב-300 פעמים G למשך 10 דקות.
לאחר השעיה מחדש של גלולת התא ב-PBS, ספור את התאים והעריך את כדאיות התא באמצעות בדיקת אי הכללה כחולה של טריפאן. מבודדים מחבל הטבור, HUVECs מאופיינים בביטוי של סמן האנדותל CD31 ובהיווצרות צינורות על מטריצת קרום מרתף. HUVECs שהועברו עם miR/PEI/MNP כולם תופסים miR מתויג.
והישרדותם נותרה ללא פגיעה 24 שעות לאחר הטרנספיקציה. בנוסף, מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה מציגה לוקליזציה פרה-גרעינית של קומפלקסים טרנספקטיביים בעלי 3 צבעים. רעילות PEI מאושרת על ידי הפונקציונליות המופחתת של תאים שעברו טרנספטציה של miR/PEI.
חשוב לציין, MNP משחזר את תכונות התא. תאים שעברו שינוי miR/PEI/MNP אינם שונים מתאים לא מטופלים מבחינת היווצרות הצינורות. יתר על כן, תאים אלה שומרים על תקשורת צומת פער בין-תאי כפי שמתגלה באמצעות התאוששות פלואורסצנטית לאחר הלבנת פוטו.
ברגע שתרחיף של תאים שעברו שינוי miR/PEI/MNP נזרע בבארות של צלחת תרבית המונחת על השייקר המסתובב, תאים נוטים לנדוד ולהיצמד לאזור יישום המגנט המקומי. תמונות מייצגות מתארות צמיחת תאים באזור עם יישום מגנט. ללא יישום מגנט.
ובמרכז התרבות באר בה זרימת הנוזל ריכזה את התאים. לאחר השליטה, ניתן לבצע טרנספקציה של תאים תוך שעתיים. לאחר צפייה בסרטון זה אמור להיות לך רושם טוב מאוד כיצד לשנות תאי אנדותל באופן חולף אך יעיל ביותר כולל המגנטיזציה.
וגם כיצד לאפיין באופן סופי את תוצר התא. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לעקוב אחר מספרים נתונים עבור כמויות זריעת תאים של רכיבים להכנת קומפלקסים של טרנספקציה, זמן הדגירה ושלב הכביסה לאחר הטרנספקציה. אנו אופטימיים מאוד שגישה זו תהיה ניתנת להעברה היטב לסוגי תאים אחרים לטיפול באיברים מושפעים אחרים.
בעקבות הליך זה ניתן לבצע מחקרים in vivo עם תאים ממוגנטים ששונו. הם יכולים לענות על שאלות נוספות האם העמסת ברזל של תאים יעילה כדי להבטיח את שימורם בצד העניין. וגם להגדיר את גבולות הזיהוי עם MRI in vivo.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
כתב יד זה מציג טכניקה להעברה יעילה ולא ויראלית של microRNA לתאי אנדותל, תוך שימוש בווקטור PEI/MNP למגנטיזציה. שיטה זו משפרת את המודיפיקציה הגנטית ומאפשרת הנחיה מגנטית של תאים ויכולת גילוי באמצעות MRI, ובכך נותנת מענה לאתגרים ברפואה רגנרטיבית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- רפואה רגנרטיבית
- טיפול תאי
- הנדסה גנטית
רקע
- טיפול תאי הוא מבטיח לטיפול במחלות לב.
- שיפור שיעור שימור התאים והישרדותם הוא קריטי.
- מודיפיקציה של MicroRNA יכולה להגביר את היעילות הטיפולית.
- מגנטיזציה מסייעת בהובלה ממוקדת של תאים.
מטרת המחקר
- הצגת שיטה להחדרת microRNA ומגנטיזציה של תאים.
- שיפור שימור התאים באתרים המיועדים באמצעות שדות מגנטיים.
- מענה לאתגרים הקשורים להישרדות ושימור של תאים במהלך השתלה.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- העברה לא-ויראלית של microRNA באמצעות וקטור PEI/MNP.
- מגנטציה של תאי אנדותל לצורך הכוונה.
- יישום של שדות מגנטיים לשיפור שימור התאים.
- הערכת יעילות המודיפיקציה הגנטית.
תוצאות עיקריות
- העברה מוצלחת של microRNA לתאי אנדותל.
- מגנטיזציה יעילה של תאים לצורך גילוי ב-MRI.
- מאפיינים משופרים של מוצרי תאים טיפוליים.
- פוטנציאל לשיפור תוצאות הטיפול התאי.
מסקנות
- הטכניקה מציעה גישה חדשנית למודיפיקציה של תאים.
- הכוונה מגנטית יכולה לשפר משמעותית את היעילות הטיפולית.
- שיטה זו נותנת מענה לאתגרים מרכזיים ברפואה רגנרטיבית.
שאלות נשאלות בשכיחות רבה
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה נותן מענה לצווארי בקבוק קריטיים בטיפולים תאיים על ידי מתן אפשרות להחדרה זמנית של microRNA ומגנטיזציה סימולטנית של תאי אנדותל, ובכך משפר את יעילות המודיפיקציה הגנטית ואת שימור התאים לאחר השתלה. גישה זו תומכת בביטחון חיזויי בתכנון מוצרי תאים טיפוליים על ידי שילוב של הנדסה גנטית עם יכולות מעקב לא פולשניות ב-MRI ומיקוד מגנטי. היא מספקת פלטפורמה לא ויראלית וניתנת להרחבה להפחתת סיכונים בהתערבויות מבוססות תאים במסלולי פיתוח של רפואה רגנרטיבית קרדיווסקולרית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה תפקודית של מנגנוני microRNA בתאי אנדותל מבלי לפגוע בחיוניות התאים או בתקשורת הבין-תאית.
- ערך תפעולי: מספק שיטה הניתנת לשחזור עבור מודולציה גנטית זמנית לצורך תיקוף של מטרות טיפוליות בביולוגיה של כלי דם.
- ערך ניבוי: תומך בהפחתת סיכונים של מטרות טיפוליות על ידי קישור ביטוי יתר של miR לתוצאות תפקודיות ביצירת צינוריות ובתקשורת דרך צמתי פער (gap junctions).
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מייצר אוכלוסיות תאים הניתנות למיון מגנטי לצורך ניתוח כמותי של יעילות הטרנספקציה והתגובה הפנוטיפית.
- ערך תפעולי: מנstandard של הכנת התאים לבדיקות המשך באמצעות יחסי קומפלקס טרנספקציה ולוחות זמנים של דגירה מוגדרים.
- ערך סקילביליות: מקל על שימוש חוזר בפלטפורמה בסוגי תאים שונים באמצעות תכנון וקטור PEI/MNP מודולרי ותהליכי הפרדה מגנטית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך תרגומי: שומר על תפקוד אנדותליאלי לאחר המודיפיקציה, ובכך תומך במידול רלוונטי למחלה של תיקון כלי דם ואנגיוגנזה.
- המשכיות פרה-קלינית: מאפשר מעקב ב-MRI והנחיה מגנטית בתנאים דינמיים מסומולצים, ובכך מגשר בין ממצאים in vitro למחקרי הובלה in vivo.
- הפחתת סיכונים: מפחית עמימות מכניסטית על ידי אישור לכך שהמגנטיזציה אינה פוגעת ביצירת צינוריות או בצימוד של צומתי פער (gap junctional coupling).
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי אספקת תאי אנדותל מהונדסים גנטית בעלי תגובה מגנטית לצורך תיקוף מטרות ופיתוח בדיקות, עם רלוונטיות תרגומית ישירה לאופטימיזציה של טיפולים תאיים בשלב הפרה-קליני.
- ביולוגיה של תגליות: תומך בבדיקת השערות באמצעות הובלה מבוקרת של miR ומדדים פנוטיפיים במבחני יצירת צינורות ותקשורת בין-תאית.
- סריקה: מספק תאים מוכנים לבדיקה עם תגובתיות מגנטית מדידה לצורך סריקה סטנדרטית של תרכובות או משנים גנטיים.
- אנליטיקה: מאפשר הפרדה כמותית של פראקציות שעברו טרנספקציה כאלו שלא, באמצעות מיון מגנטי, מה שמשפר את דיוק הנתונים בניתוח תאים שעברו דרך המערכת ותאים שנותרו בה.
- מחקר טרנסלציונלי: תומך ברציפות פרה-קלינית על ידי מתן אפשרות למעקב MRI לא פולשני ומיקוד מגנטי בתנאים דמויי פרפוזיה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה רב-פעמית לטרנספקציה ומגנטיזציה שניתן להתאימה לסוגים אחרים של תאים ראשוניים ליישומים וסקולאריים ורגנרטיביים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה באמצעות מודולציה גנטית ופונקציונלית משולבת של תאי אנדותל.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של יעילות הטרנספקציה והשחזור באמצעות יחסי PEI/miR/MNP מוגדרים ושלבי אינקובציה מתוזמנים.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות go/no-go על ידי הפחתת סיכוני כישלון בשלבים מאוחרים הקשורים לאחזקת תאים נמוכה ולהשתבצות זמנית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מועמדים לטיפול תאי בהתאמה לסיכון, באמצעות מוצרים תאיים ניתנים למעקב ומתוּקפים פונקציונלית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטרנספקציית חומצות גרעיניות, טיפול בננו-חלקיקים ומיקרוסקופיית פלואורסצנציה לצורך תיקוף.
- תלוי בגישה לציוד סוניקציה, עמודי הפרדה מגנטית ומערכות דימוי confocal/SIM.
- מחייב סטנדרטיזציה של צפיפות זריעת התאים (13,000 cells/cm²) והכנת קומפלקס הטרנספקציה בין מעבדות שונות.
- כולל שיקולי התאמה לסוגים שונים של תאי אנדותל או תאי אב בנוגע ליעילות הטרנספקציה והתגובה למגנט.
- כולל מגבלות מעשיות כגון הצורך באופטימיזציה של מינון ה-miR וריכוז ה-PEI כדי למזער ציטוטוקסיות תוך שמירה על המגנטיזציה.
