לא פולשנית דגימה של נוזל שורות Mucosal עבור כימות של In Vivo דרכי הנשימה העליונות החיסון-מגשרת רמות
7 באוגוסט 2017
פרוטוקול זה מתאר שיטה לא פולשנית עבור הדגימה של נוזל ללא הפרעה של שורות mucosal של דרכי הנשימה העליונות. זה יכול לשמש כדי לבצע כימות של ויוו רמות של חלבונים מתווכים, כגון ציטוקינים, נוגדנים, המקצועות לכל הגילאים.
המטרה הכוללת של שיטת דגימת נוזל רירית זו היא לחקור את החתימה החיסונית המקומית של דרכי הנשימה ללא צורך בהליכי גירוי. שיטה זו מאפשרת לך ללמוד שאלות מפתח בתחום מחלות נשימה בילדים כמו זיהומים, אסטמה ואלרגיה. היתרונות של השיטה הם שניתן למדוד רמות נמוכות מאוד של מתווכים חיסוניים ברירית דרכי הנשימה הלא מגורה in vivo.
הדגמת ההליך תיעשה על ידי ד"ר וולסק. לאיסוף מדגם יילודים, ראשית לחתוך לפחות שתיים רצועות שלוש על 15 מילימטר מיריעות סינון פוליאסטר הידרוקסיל סיביות. לאחר מכן, הניחו את היילוד על מיטה ושימו לב לכל תסמינים של זיהום בדרכי הנשימה.
לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי להכניס פיסת נייר סינון אחת כסנטימטר אחד לחלק הקדמי של הטורבינת התחתונה של כל נחיר של התינוק ולתת מי סוכר ליילוד לנוחות לפי הצורך. שימו לב לכל התעטשות, בכי מתמשך או אפיסטקסיס המתרחשים במהלך תקופת הדגימה. לאחר שתי דקות של ספיגה, העבירו את ניירות הסינון לצינור מסומן לאחסון מיידי בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס.
מי שתדגים את הליך הניסוי תהיה ליסבת רוזהולם, טכנאית במעבדה שלי. לכימות מתווך חיסוני של דרכי הנשימה, הניחו עד 10 דגימות מאחסון שלילי של 80 מעלות צלזיוס על קרח ורשמו את מספרי הזיהוי שלהן. לאחר שהדגימות הופשרו, טבלו את שני ניירות הסינון לכל נבדק ב-150 מיקרוליטר של חיץ טרי שהוכן לכל נייר סינון, בתוספת טבליה אחת שלמה של מעכב פרוטאז לכל 25 מיליליטר של תמיסת מלאי חיץ.
מעבירים את הדגימות לשייקר צלחת ב -400 סל"ד למשך חמש דקות. העבירו את ניירות המאגר והסינון לכוסות של מסנני צינור אצטט תאית בודדים. צנטריפוגה את הדגימות כדי לאסוף את תמצית האף המסוננת בתחתית צינורות המיקרו-צנטריפוגה.
לאחר מכן, הסר את הכוסות והניח את הצינורות על קרח. לאחר מכן, העבירו 150 מיקרוליטר של תמצית האף לבארות בודדות של צלחות אחסון נמוכות חלבון ואחסנו את הצלחות בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס עד לניתוח. לאחר מכן, מדוד את ריכוז המתווכים החיסוניים באף המעניינים על ידי מערך מרובה מבוסס אלקטרוכימילומינסנציה ברגישות גבוהה על פי פרוטוקולי בדיקה סטנדרטיים.
בניתוח מייצג זה של 620 יילודים, רוב המתווכים החיסוניים שנמדדו הראו רמת זיהוי נמוכה. רמות הגמא של IFN היו מתחת לגבול הזיהוי התחתון בכמעט מחצית מהדגימות, בעוד שרמות TNF alpha, CCL4 ו-TGF beta היו מתחת לגבול הזיהוי התחתון בפחות מ-1% מהדגימות. רב-קולינאריות חזקה ניכרה עבור 20 רמות המתווך שזוהו, כפי שמודגם על ידי מפת החום.
בילודים נגועים בנגיף הפיקורנה ללא תסמינים, נצפה פרופיל מווסת שנפגע בעיקר של מתווכים חיסוניים מסוג 1, מה שמרמז על תפקיד מעורר חיסון של חיידקים ווירוסים מתיישבים בחלק המוקדם ביותר של החיים. נקבע גם קשר בין נוכחות של אחים במשק הבית בלידה, לבין תגובה חיסונית מכוונת ספציפית מסוג 1 מסוג 17 עם ראיות למתאם של תופעה זו עם אפקט תחול חיסוני ברחם שנמצא בקורלציה הפוכה לזמן שחלף מאז הלידה האחרונה. בנוסף, ילדים שנולדו לאימהות שקיבלו תוספי תזונה ברמה גבוהה לעומת פלצבו התאפיינו בוויסות מוגבר במתווכים חיסוניים ספציפיים, מה שמרמז על כך שוויטמין D מקדם תגובה חיסונית אנטיבקטריאלית שאינה תלויה בזו הנגרמת על ידי וירוס, חיידקים, אחים או אטופיה אימהית.
ניתן להשתמש בשיטה זו של מיקרו-דגימה גם באמצעות ברונכוסקופ, המאפשר לחקור את המתווכים החיסוניים בדרכי הנשימה התחתונות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למדוד מתווכים ברירית דרכי הנשימה הלא מגורה in vivo ביילודים ובילדים גדולים יותר.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר טכניקה לא פולשנית לדגימה של נוזל רירית לא מופרע מדרכי הנשימה העליונות. הוא מאפשר כימות של רמות in vivo של מתווכי חלבון, כגון cytokines ו-chemokines, בנבדקים בכל הגילאים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מחלות נשימה
- אימונולוגיה
- פדיאטריה
רקע
- שיטה זו בוחנת את החתימה החיסונית המקומית של דרכי הנשימה ללא הליכי גרייה.
- היא ישימה למחלות נשימה בילדים, כגון זיהומים, אסתמה ואלרגיה.
- הטכניקה מאפשרת מדידה של רמות נמוכות של מתווכי חיסון ברירית דרכי נשימה שאינה מגורה in vivo.
- הדגמת הפרוצדורה מבוצעת על ידי ד"ר Wolsk.
מטרת המחקר
- לבדיקת התגובה החיסונית ברירית דרכי הנשימה.
- לספק תובנות לגבי מצבים נשימתיים בילדים.
- להקל על טכניקות דגימה לא פולשניות למטרות מחקר.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- איסוף נוזל רירית מהדרכים הנשימיות העליונות.
- שימוש בגילי סינון מפוליאסטר הידרוקסילאטי סיבי לאיסוף דגימות.
- מעקב אחר תסמינים של זיהום בדרכי הנשימה בילודים.
- כימות של ציטוקינים וכימוקינים בדגימות שנאספו.
תוצאות עיקריות
- איסוף מוצלח של נוזל רירית ללא פרוצדורות פולשניות.
- יכולת למדוד מתווכי חיסון in vivo.
- תובנות לגבי הפרופיל החיסוני של מטופלים פדיאטריים.
- יישומים פוטנציאליים בהבנת מחלות נשמתיות.
מסקנות
- שיטת הדגימה הבלתי פולשנית יעילה לחקר החסינות של דרכי הנשימה.
- טכניקה זו יכולה לשפר את המחקר בתחום בריאות הנשימה של ילדים.
- מחקרים עתידיים עשויים להרחיב את הממצאים הקשורים למתווכי חיסון.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו לדגימה לא פולשנית של נוזל רירית המגנה מאפשרת כימות ישיר של מתווכי חיסון in vivo ברירית דרכי הנשימה העליונות ללא גירוי, ובכך מספקת מדד רלוונטי פיזיולוגית לפעילות החיסונית בדרכי הנשימה. הטכניקה תומכת בפרופיל חיסוני בשלבי חיים מוקדמים ובניטור לאורך זמן, ובכך מסייעת בהפחתת סיכונים מנגנוניים בפיתוח טיפולים נשימתיים על ידי קישור חשיפות גנטיות וסביבתיות לפנוטיפים חיסוניים. יישומה בקוהורטות של ילודים וילדים מציע ערך ניבוי עבור אנדוטיפינג (endotyping) וניטור התקדמות מחלה, במיוחד בהקשרים של אסתמה, אלרגיה ומחלות זיהומיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי מדידת רמות בסיס ורמות מושראות של מתווכי חיסון ברקמה רירית שאינה מעוררת.
- ערך תפעולי: מספק מטריקס הניתן לשחזור ופולשני במינימום עבור תיקוף תפקודי של מטרות באוכלוסיות ילדים.
- ערך ניבוי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות קורלציה בין פרופילי מתווכים לבין פנוטיפים קליניים, כגון זיהום נגיפי אסימפטומטי והשפעות של חשיפה דרך אחים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- מוכנות לבדיקה: מייצר דגימות חלבון שנסחפו (eluted), התואמות למערכי Multiplex של אלקטרו-כימילומינצנציה ברגישות גבוהה לצורך פרופיל חיסוני כמותי.
- סטנדרטיזציה: משתמש בפרוטוקולי ספיגה ושטיפה עקביים של נייר סינון כדי להבטיח השגה (recovery) הדירה של אנליטים בין נבדקים ונקודות זמן שונות.
- יכולת הרחבה (Scalability): הוכח כי השיטה ישימה בקוהורטים גדולים של רכים ליום (n=620), דבר התומך ביישומים של סריקה בספיקה גבוהה במחקרים אפידמיולוגיים ומחקרים התערבותיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מאפשרת דגימה לאורכית מרגע הלידה ועד הילדות, ומקשרת בין חתימות חיסוניות בשלב מוקדם של החיים לבין תוצאות של מחלות נשימתיות בשלב מאוחר יותר.
- סנכרון סממנים ביולוגיים: מזהה עלייה בביטוי (upregulation) של מתווכי חיסון מסוג 1 ומסוג 17 בילודים נגועים בפיקורנו-וירוס ללא תסמינים, מה שמצביע על תועלת בזיהוי אנדוטיפים חיסוניים.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: חושפת קשרים בין תוספת ויטמין D אימהית לבין תגובות חיסוניות אנטי-בקטריאליות, ובכך תומכת בתעדוף מטרות להתערבויות אימונו-מודולטוריות.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת בשלב הביולוגיה של הגילוי על ידי כך שהיא מאפשרת מדידה ישירה של מתווכי חיסון in vivo, ובכך מספקת מידע לבחירת מטרה ולהבהרת מסלולים לפני זיהוי מולקולת מובילה (lead).
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי הפעלת מסלולים חיסוניים ברקמה רירית ללא מניפולציות ex vivo או ארטיפקטים של גרייה.
- סריקה: מייצר תמציות (eluates) סטנדרטיות המתאימות לקריאות של בדיקות חיסוניות מרובות (multiplex immunoassay), דבר המקל על ניתוח השוואתי בין קבוצות טיפול או חשיפה.
- אנליטיקה: מייצר רמות כמותיות של מדיאטורים המאפשרות הערכה סטטיסטית של קולינאריות, פעילות רשת חיסונית וקשרי פנוטיפ.
- מחקר תרגומי: מקשר בין פרופילים חיסוניים של ילודים לבין תסמינים נשימתיים בילדות וחשיפות סביבתיות, ובכך תומך בהחלטות קידום מבוססות רמות סיכון.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה טכניקת דגימה תואמת-פלטפורמה, הישמה במגוון מודלים של מחלות נשימה ושיטות טיפוליות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה על ידי לכידה של פעילות חיסונית אנדוגנית במיקרו-סביבה רירית טבעית.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזור באמצעות נהלי איסוף, אלוציה ואחסון סטנדרטיים, ובכך מצמצם שונות פרה-אנליטית.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי קישור מנגנונים אימונומודולטוריים לחתימות חיסוניות בשלבים מוקדמים של החיים, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתוכניות נשימתיות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מועמדים מותאם-סיכון על בסיס השפעות מוכחות על מסלולים חיסוניים ריריים במודלים אנושיים רלוונטיים ואורכיים.
שיקולי יישום
- נדרשת הכשרה באנטומיה של דרכי הנשימה של יילודים ובטכניקת דגימה עדינה כדי להבטיח את נוחות הנבדק ואת שלמות הדגימה.
- תלוי בגישה לפתעות סינון אולטרה (ultrafilter tubes), לנעורי פלטות (plate shakers) ולתשתית של בדיקת אימונו-סבסבסנציה (electrochemiluminescence immunoassay) לזיהוי האנליט.
- מחייב הכנה סטנדרטית של תמיכה (buffer) עם מעכבי פרוטאז כדי למנוע פירוק של המתווכים במהלך החילוץ.
- נדרש התאמה של משך הדגימה או גודל המסנן כאשר הפרוטוקול מיושם על ילדים מבוגרים יותר או על אתרים ריריים חלופיים.
- מוגבל על ידי שכיחות האנליט, כאשר חלק מהמתווכים נמצאים לעיתים קרובות מתחת לסף הגילוי, מה שמחייב אופטימיזציה של רגישות הבדיקה עבור מטרות בעלות ביטוי נמוך.
