הרחבת אדיפוגנזה השראה של אבות אדיפוציטים מ רקמות אדיבוס perivascular מבודדים על ידי מיון מגנטי המופעל תא

המטרות הכוללות של פרוטוקולי בידוד והתמיינות אלה הן להשיג תאי אב אדיפוציטים מרקמות שומן פרי-וסקולריות, ולגרום להתמיינות שלהם לאדיפוציטים בוגרים. שיטה זו מאפשרת ניתוח של אוכלוסיות תאי אב שומן ספציפיות ומוגדרות מרקמת שומן פריוסקולרית, עם השפעה מינימלית על המורפולוגיה, הכדאיות והפוטנציאל שלהם להתרבות ולהתמיין. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת בידוד מוגבר של תאים מציגי אנטיגן לגרם רקמת שומן, בהשוואה למיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות.

לאחר אישור חוסר תגובה לצביטה בבוהן, בצע חתך אנכי בקו האמצע לאורך עצם החזה לאזור הפרינאום של החולדה, כדי לגשת לחלל הבטן. לחשוף את העורק המזנטרי העליון, את כלי ההתנגדות המזנטרי הקטנים ואת אבי העורקים החזי, ולנתק את כל הקשרים למזנטריה ולאבי העורקים. אסוף את רקמת השומן של בלוטת המין והעביר את רפידות השומן המבודדות למיכל חדש של מאגר קרבס-רינגר, או תמיסת KRBB, בתוספת ערימות של 10 מילי-מולריות.

מעבירים את הכלים לצלחת פטרי המכילה תמיסת KRBB, ומניחים את המנה מתחת למיקרוסקופ מנתח. הסר רקמת שומן פריוסקולרית מכלי ההתנגדות המזנטרית הקטנים ומאבי העורקים. במכסה מנוע של בטיחות ביולוגית, העבירו כ-50 מיליגרם של רקמה לתוך שפופרת של 1.7 מיליליטר המכילה 1 מיליליטר של תמיסת קולגנאז מסוג I, וטחנו את הרקמה לחתיכות של 1 עד 3 מילימטרים.

חשוב לטחון כראוי את רקמת השומן כדי לאפשר לקולגנאז לחדור ביסודיות לרקמת החיבור. דגרו את השברים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור למשך שעה. לאחר מכן סנן ברצף את החומר המעוכל דרך מסנני תאים בודדים של 100 ו-40 מיקרון לתוך צינור של 50 מיליליטר.

אסוף את הסינון שנוצר על ידי צנטריפוגה, והשהה מחדש את הגלולה ב-1 מיליליטר של מאגר ליזה אריתרוציטים. העבירו את מתלה התא לצינור מיקרופוגה חדש בנפח 1.7 מיליליטר לדגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור. לאחר מכן אסוף את תאי שבר כלי הדם הסטרומלי עם צנטריפוגה נוספת והשהה מחדש את הגלולה במדיום בסיסי של שבר כלי דם סטרומלי לספירה.

כדי לבודד את תאי האב של השומן על ידי מיון תאים המופעל על ידי מגנטית, אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה, והשהה מחדש את הגלולה במאגר חוסם תאים המופעל על ידי מגנטית בריכוז של 1 כפול 10 לתאים 6 למיליליטר למשך דגירה של 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. חיוני שכל שלבי הבידוד ייעשו ב-4 מעלות צלזיוס, ולא על קרח. לאחר מכן, דגרו על התאים עם 5 מיקרוליטר של עכבר מצומד ל-FITC אנטי-CD34 למשך 30 דקות.

אוספים את התאים באמצעות צנטריפוגה. לאחר מכן דגרו על התאים עם 4 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזים נגד FITC ב-96 מיקרוליטר של מאגר מיון תאים מופעל מגנטי למשך 5 דקות בחושך. בזמן שהתאים דוגרים, הנח עמודה מרובת מיון לתוך המפריד המגנטי עם צינור פסולת של 5 מיליליטר מתחת לעמודה.

שטפו את העמוד עם 500 מיקרוליטר של מאגר מיון תאים המופעל על ידי מגנטים, והשליכו את צינור הקולחין והפסולת. לאחר מכן הנח צינור חדש מתחת לעמודה, וטען את התאים על החלק העליון של העמודה, ואסף את התאים השליליים CD34 הלא מסומנים בצינור האיסוף החדש. כאשר כל התאים עברו דרך החלק העליון של העמודה, שטפו את העמודה 3 פעמים עם 500 מיקרוליטר של מאגר מיון תאים המופעל על ידי מגנטים, והמשיכו לאגור את הפליטה בצינור האיסוף.

לאחר הכביסה האחרונה, העבירו את העמודה לצינור איסוף חדש, והשתמשו בבוכנת העמודה כדי לשטוף 1 מיליליטר של מאגר מיון תאים המופעל על ידי מגנטית דרך העמודה לתוך הצינור, כדי לאסוף את התאים החיוביים CD34. אסוף את תאי האב של השומן על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן דגרו את השבר החיובי CD34 ב-10 מיקרוליטר של קולטן גורם גדילה שמקורו בטסיות דם אלפא למשך 30 דקות.

בתום הדגירה, צנטריפוגה שוב של התאים, ודגירה על הגלולה ב-4 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזי IgG נגד ארנב ב-96 מיקרוליטר של מאגר מיון תאים מופעל מגנטי לבידוד חרוזים מגנטיים של תאי קולטן גורם גדילה אלפא חיובי שמקורו בטסיות, כפי שהודגם זה עתה. כדי לתרבית את קולטן גורם הגדילה החיובי CD34 שמקורו בטסיות דם תאי אב אלפא חיוביים, זרעו את התאים בצלחות תרבית רקמה בודדות של 6 בארות במדיום בסיסי, והניחו את הלוחות בחממת תרבית תאים של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר 3 מעברים סדרתיים, זרעו את התאים לתוך צלחות תרבית רקמה שחורות של 96 בארות ב-1 כפול 10 ל-2 תאים לבאר, והעריכו את התפשטותם ב-8, 24, 48 ו-96 שעות ב-5 כפול 10 לתאים הרביעיים לבאר, בלוחות בדיקה של 24 בארות, על פי פרוטוקולי בדיקת התפשטות סטנדרטיים.

כדי לגרום לאדיפוגנזה, כאשר תרבית תאי אב השומן מגיעה למפגש, האכילו את התאים במדיום בסיסי אב אדיפוציטים למשך 48 שעות, ולאחר מכן טפלו בתרביות בחלבון מורפוגני עצם 4 למשך 48 שעות נוספות. ביום השלישי, החלף את המדיום במדיום אינדוקציה של תאי אב אדיפוציטים, ללא IBMX ו-examethasone למשך 14 יום. לאחר מכן ניתן להעריך את מידת האדיפוגנזה בתרביות ב-1 כפול 10 לתאים הרביעיים לבאר בצלחות תרבית רקמה של 48 בארות, על פי פרוטוקולי בדיקת אדיפוגנזה סטנדרטיים.

למרות ששתי השיטות מדגימות התפלגות וכדאיות דומות של אוכלוסיית התאים, בידוד מיון תאים המופעל על ידי מגנטיות מייצר מספר גדול יותר של תאים לתרבית, בהשוואה למיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות. בניסוי מייצג זה, התפשטות במבחנה של מקטע כלי דם סטרומלי ממוין בתאים מגנטיים ותאי אב אדיפוציטים, מבודדים מאבי העורקים החזיים, כלי התנגדות מזנטרי קטנים ורקמת שומן גונדלית של חולדות זכרים, הוערכה ב-8, 24, 48 ו-96 שעות לאחר הציפוי, באמצעות בדיקת DNA כמותית. לא נצפו הבדלים באתרים בשיעורי התרחבות שבר כלי הדם הסטרומלי בשום נקודת זמן, למעט תאי האב האדיפוציטים מאבי העורקים החזי, שהראו פחות התפשטות ב-96 שעות, בהשוואה לתאי כלי דם סטרומליים מאותו אתר.

גירוי של תאי אב שומן עם חלבון מורפוגני בעצם 4 למשך 48 שעות גורם להתמיינות אדיפוציטים, כפי שמעידה הצטברות שומנים גדולה יותר בטיפות, כפי שהוערך הן על ידי בדיקת ספיגת שומנים פלואורסצנטית והן על ידי צביעת שמן אדום O. לאחר השליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך 8 שעות, אם היא מבוצעת כהלכה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על טמפרטורות של 4 מעלות צלזיוס במהלך שלבי הבידוד.

לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד ולהבדיל תאי אב של אדיפוציטים.