ויזואליזציה של דפוס היטל אקסונל של נוירונים מוטוריים עובריים ב תסיסנית
16 ביוני 2017
עבודה זו מפרטת שיטת אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית כדי לדמיין תחזיות נוירונים מוטוריים של שלב מאוחר 16 תסיסנית עוברי melanogaster . הכנת הפילה של עוברי קבוע מוכתמים נוגדן FasII מספק כלי רב עוצמה לאפיין את הגנים הנדרשים עבור pathoninding האקסון המנוע ואת ההכרה היעד במהלך התפתחות עצבית.
המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לנתח את דפוסי הקרנת הנוירונים המוטוריים בעוברים בשלב מאוחר של Drosophila melanogaster. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ההתפתחות העצבית, כגון הנחיית אקסון מוטורי והיווצרות תת-עצבי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת הדמיה מדויקת של האקסון המוטורי בעוברים מתפתחים, המאפשרת ניתוח אמין של מציאת נתיב אקסונלי ומיקוד הפגם במצב.
יום לאחר הקמת צלחות איסוף הביצים, החליפו את הצלחות בחדשות המכילות מעט רסק שמרים טרי. לאחר שלוש שעות על הצלחות הטריות, העבירו את הזבובים לבקבוקי מזון חדשים. ודוגרים את צלחות הביצים למשך הלילה בחום של 25 מעלות צלזיוס.
בבוקר מוסיפים 1.8 מיליליטר תמיסת PBT לצלחות. והשתמש בצמר גפן כדי לעקור את העוברים. לאחר מכן, בעזרת פיפטה של 1 מיליליטר, העבירו את העוברים והתמיסה לצינור מיקרו צנטריפוגה.
לאחר שהעוברים מתיישבים לתחתית, שאפו כמה שיותר תמיסה. לאחר מכן שטפו את העוברים פעמיים באמצעות מיליליטר PBT אחד לכל שטיפה. כדי לפרק את העוברים, החליפו את השטיפה האחרונה במיליליטר אחד של 50% אקונומיקה ונדנדו את הצינור למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.
כדי להסיר את האקונומיקה, שטפו את העוברים שלוש פעמים עם PBT. לאחר מכן, החלף את השטיפה האחרונה בחצי מיליליטר של 100% הפטן וחצי מיליליטר של 4% פרפורמלדהיד. כעת, דגרו על העוברים למשך 15 דקות עם נדנוד עדין.
לאחר הדגירה, הסר את שכבת התמיסה הבסיסית והוסף בחזרה 500 מיקרוליטר של 100% מתנול. כעת, למשך 30 שניות, נער את הצינור במרץ כדי להוציא את העוברים. לאחר מכן, הסר את התמיסה שמעליו, הוסף בחזרה 500 מיקרוליטר של 100% מתנול ונער את הצינור למשך 10 שניות נוספות.
לאחר ניעור הצינור, הקש עליו כדי לעזור לעוברים להתיישב ולהסיר כמה שיותר תמיסה. לאחר מכן, שטפו בקצרה את העוברים עם 100% מתנול. לאחר מכן, שטפו מיד את העוברים עם PBT שלוש פעמים.
כעת, השעו את העוברים במיליליטר אחד של PBT טרי. ודגרו על העוברים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי להכין אותם לצביעה של LacZ. בזמן שהעוברים דוגרים, הכינו מינון של מיליליטר אחד של תמיסת צביעה X-gal.
מחממים את האליקוט באמבט מים של 65 מעלות צלזיוס עד שהוא מתענן. לאחר מכן העבירו אותו לגוש חום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר חימום העוברים במשך 15 דקות, הסר את תמיסת ה-PBT, והחלף אותה במיליליטר אחד של תמיסת צביעה.
לאחר מכן הוסף 20 מיקרוליטר של מצע X-gal. במשך כשעתיים עד ארבע שעות, דגרו את הצינור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם נדנוד עדין עד שנוצר משקע כחול. לאחר מכן, הסר את תמיסת הצביעה ושטוף את העוברים שלוש פעמים עם PBT בטמפרטורת החדר.
לאחר השטיפה, השתמש בבדיקת מחט או במלקחיים כדי למיין את העוברים ביד תחת מיקרוסקופ דיסקציה. אוספים את העוברים המוכתמים המעניינים לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה של חצי מילימטר באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד. לאחר מכן, שטפו את העוברים שנבחרו עם 0.4 מיליליטר PBT.
לאחר מכן, החלף את ה-PBT ב-0.3 מיליליטר של תמיסת חסימה ואפשר לעוברים לדגור בתסיסה עדינה למשך 15 דקות. לאחר 15 דקות מוסיפים 75 מיקרוליטר מהנוגדן הראשוני וממשיכים את הדגירה למשך הלילה. למחרת בבוקר יש לשטוף את העוברים ב- PBT למשך כשעתיים, ולהחליף את תמיסת הכביסה כל 30 דקות בערך.
לאחר הכביסה יש להוסיף 0.3 מיליליטר של תמיסת חסימה המכילה את הנוגדן המשני ולדגור את הצינור עם נדנוד עדין בטמפרטורת החדר למשך הלילה. למחרת בבוקר יש לשטוף את העוברים ב-PBT למשך כשלוש שעות. החלף את ה-PBT לפחות חמש פעמים במהלך תקופת הכביסה.
לאחר הכביסה יש להשעות את העוברים ב 0.3 מיליליטר תמיסת טפיחה ולהוסיף שני מיקרוליטר של מי חמצן 3%. לאחר מכן, דגרו אותם בחושך עם נדנוד עדין בטמפרטורת החדר עד להפקת מספיק משקעים. זה בדרך כלל לוקח 30 עד 60 דקות.
לאחר מכן, שטפו את העוברים עם PBT ארבע פעמים והשעו אותם מחדש ב-0.2 מיליליטר של תמיסת הרכבה. כעת, אפשרו לעוברים להתייצב בחושך ב-4 מעלות צלזיוס. כדי להגיש את העוברים, ביימו אותם על מגלשת זכוכית.
ראשית העבירו אותם לטיפה של גליצרול בצד הגחון כלפי מעלה. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ דיסקציה, חתכו את החלק הקדמי ו -1/4 מאורך הגוף והסירו את האזור האחורי ביותר, הנקי מאקסונים מוטוריים. כעת, בעזרת בדיקת מחט, הזיזו את התכשיר מהגליצרול, כשהצד הגבי מכוון כלפי מעלה ומקמו אותו אופקית בשדה הראייה.
השלב הבא דורש מחט טונגסטן עדינה שהוחדרה לאזור החלול של בדיקת מחט, ולאחר מכן כפופה בקצה. בעזרת מחט הטונגסטן מבצעים חתך קטן בקצה האחורי של העובר וממשיכים לחתוך את קו האמצע הגבי. ודא שקצה מחט הטונגסטן אינו נוגע במשטח מגלשת הזכוכית במהלך הדיסקציה, מכיוון שהמחט תתכופף בקלות כנגד הזכוכית.
לאחר מכן, עם הגשושית החזירו את ההכנה לטיפת הגליצרול ומקמו אותה בצד הגב כלפי מעלה. שם, נתק את המעי מדופן הגוף על ידי פתיחת כל דופן גוף בכיוון הגחון-לרוחב. שני קירות הגוף צריכים להתפרק.
כעת, בעזרת הגשושית, הזיזו בזהירות את דשי קיר הגוף על מגלשת זכוכית. בשקופית, השתמש במחט טונגסטן כדי להסיר את האיברים הפנימיים על ידי דחיפתם לרוחב. כדי לייצב את מחט הטונגסטן ולמנוע ממנה להינזק, שמור על המחט החלולה נבדק והחזק את מחט הטונגסטן צמודה אל פני מגלשת הזכוכית תוך מניפולציה של מחט הטונגסטן.
כעת, הרכיבו את התכשירים בשמונה מיקרוליטר של תמיסת הרכבה על מגלשת זכוכית חדשה. צרף תלוש כיסוי ואטום את הקצוות כלפי מטה עם לק רגיל. לאחר מכן, צלם תמונות ברזולוציה גבוהה באמצעות אופטיקה של DIC.
באמצעות השיטה המתוארת, עוברי שלב 16 נצבעו בנוגדני Fas2 והוכנו להדמיה של הנוירונים המוטוריים ומקטעי חצי הבטן A3 ו-A4. בדרך כלל, לפחות שבעה נוירונים מוטוריים מתרחבים ומרתקים את האקסונים שלהם ליצירת ענף עצב ISNb. צרורות עצבים רבים מסביב היו ניתנים לזיהוי גם בתכשיר זה. כאשר צרור העצבים הבין-סגמנטלי מגיע לנקודת הבחירה בשריר 6 ו-7, שני אקסונים מבטלים באופן סלקטיבי את שרירי 6 ו-7.
אותו הדבר קורה בנקודות בחירה אחרות כאשר החבילה נמשכת בגב. ואז, בנקודת הבחירה האחרונה, שני אקסונים מעכבים את שריר 12. לעומת זאת, בעוברים מוטנטיים של Sema-1a אותם אקסונים לא מצליחים להתפרק בנקודות הבחירה שלהם.
זה לא בלתי צפוי מכיוון שהתוצר האגאי Sema-1 ידוע כמסייע ביצירת קשרים בין אקסונים מוטוריים לשרירי מטרה במהלך ההתפתחות העצבית. לפיכך, ניתן להשתמש בשיטה המתוארת לניתוח פנוטיפים מוטנטיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למיין את העוברים המוטנטיים הרצויים, כיצד לצבוע את דפוסי ההקרנה האקסונלית של נוירונים מוטוריים, וכיצד לנתח עוברים קבועים להכנה שטוחה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
עבודה זו מפרטת שיטה סטנדרטית של אימונוהיסטוכימיה להדמיה של השליחות של נוירונים מוטוריים בעוברי *Drosophila melanogaster* בשלב מאוחר של stage-16. השיטה מספקת הדמיה מדויקת של סלילת נתיבי האקסונים המוטוריים וזיהוי המטרות במהלך ההתפתחות העצבית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי העצבים
- ביולוגיה התפתחותית
- אימונוהיסטוכימיה
רקע
- דפוסי ההקרנה של נוירונים מוטוריים הם חיוניים להבנת ההתפתחות העצבית.
- *Drosophila melanogaster* משמש כאורגניזם מודל לחקר תהליכים אלו.
- אימונוהיסטוכימיה מאפשרת ויזואליזציה מפורטת של מבנים נוירונליים.
- הבנת התניחות של אקסונים יכולה לספק תובנות לגבי היווצרות מעגלים עצביים.
מטרת המחקר
- לניתוח דפוסי ההקרנה של נוירונים מוטוריים בעוברים בשלב מאוחר.
- לחקירת הגנים המעורבים בהנחיית אקסונים מוטוריים.
- לשיפור ההבנה של מנגנוני ההתפתחות העצבית.
שיטות שהשתמשו בהן
- הכנת פילטים של עוברי Drosophila מקובעים.
- צביעה באמצעות נוגדן FasII לצורך ויזואליזציה.
- ניתוח של סלילת נתיבי אקסונים מוטוריים וזיהוי מטרות.
- פרוטוקולים של דגירה והכנה של עוברי עוברים.
תוצאות עיקריות
- ויזואליזציה מוצלחת של השלוחות של נוירונים מוטוריים.
- זיהוי גנים מרכזיים המעורבים בהנחיית אקסונים.
- תובנות לגבי מנגנוני ההתפתחות העצבית.
- ביסוס שיטה אמינה למחקרים עתידיים.
מסקנות
- שיטת האימונוהיסטוכימיה יעילה לחקר השליחות של נוירונים מוטוריים.
- גישה זו יכולה לסייע בביאור הבסיס הגנטי של ההתפתחות העצבית.
- הממצאים תורמים להבנה רחבה יותר של סלילת נתיבי האקסונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ויזואליזציה מדויקת של תבניות ההקרנה האקסונית בנוירונים מוטוריים של עוברים של Drosophila מאפשרת בחינה מעמיקה של היווצרות מעגלים עצביים ומנגנוני הנחיית אקסונים. יכולת זו היא קריטית להפחתת סיכונים בשלבי תיקוף המטרה המוקדמים במחקר נוירו-התפתחותי, ותומכת באמון חיזוי בצינורות של סריקה גנטית. השחזוריות של השיטה והתוצרים הכמותיים שלה מקלים על אינטגרציה של מו"פ רב-תחומי ותעדוף תיקי פרויקטים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר הערכה ישירה של תפקוד גנים בניתוב אקסונים מוטוריים ובזיהוי מטרות.
- תומך בהסרת סיכונים מכניסטיים באמצעות ויזואליזציה של השלכות פנוטיפיות של שיבושים גנטיים.
- מקל על תיקוף תפקודי של מטרות באמצעות סריקות גנטיות של אובדן תפקוד (loss-of-function) והגברת תפקוד (gain-of-function).
- מספק פלטפורמה לחקירה מונחית-השערה של מסלולי התפתחות עצבית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק פרוטוקולים סטנדרטיים של אימונוהיסטוכימיה וניתוח (dissection) להכנת דגימות ניתנת לשחזור.
- מייצר תוצאות כמותיות ואיכותיות של דפוסי היטל אקסוניים עבור יישומי סריקה.
- מאפשר הערכה ניתנת להרחבה (scalable) של וריאנטים גנטיים המשפיעים על קישוריות נוירו-שרירית.
- מכין מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף עבור תהליכי עבודה של סריקה פנוטיפית בהמשך.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים רלוונטיים למחלה לצורך חקר היווצרות ותפקוד לקוי של מעגלים נוירו-שריריים.
- תומך בזיהוי סמנים ביולוגיים תרגומיים על ידי קישור הפרעות גנטיות לפנוטיפים ניתנים לצפייה.
- מספק רציפות משלב הסריקות הגנטיות של תגליות ועד לתיקוף של מודלים פרה-קליניים.
- מפחית סיכונים בקבלת החלטות על קידום המחקר על ידי הבהרת הבסיס המכניסטי של ההתפתחות העצבית.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow Integration)
פרוטוקול הוויזואליזציה זה משתלב ברצף הגילוי, החל מזיהוי מטרות גנטיות דרך סריקה פנוטיפית ועד לתיקוף של מודלים פרה-קליניים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים בהכוונת אקסונים ובהרכבת מעגלים עצביים.
- סריקה: מספק פלט כמותי הניתן לשחזור לצורך השוואת מצבים גנטיים וסריקת גנים מועמדים.
- אנליטיקה: מאפשר ניתוח סטטיסטי של דפוסי היטלי אקסונים להבחנה בין מחלקות פנוטיפיות.
- מחקר תרגומי: מגשר בין ממצאי גילוי מוקדמים למודלים פרה-קליניים רלוונטיים למחלות של הפרעות נוירו-שריריות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר עבור יוזמות מתמשכות של סריקה גנטית ופנוטיפית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי התפתחות עצבית.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה להכנת דגימות ולדימות לצורך הדירות ויכולת הרחבה בין צוותי מו"פ.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים מוקדמת של מטרות גנטיות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום של תוכניות מחקר נוירו-שריריות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגנטיקה של Drosophila, אימונוהיסטוכימיה ודיסקציה של עוברי דרוזופילה.
- דורש גישה לפלטפורמות דימוי ברזולוציה גבוהה ולריאגנטים של נוגדנים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של טיפול בדגימות ופרוטוקולי צביעה.
- ייתכן שיהיה צורך בהתאמה לרקעים גנטיים שונים או לשלבי התפתחות שונים.
- התפוקה עשויה להיות מוגבלת בשל שלבי הדיסקציה והדימוי הידניים.
שאלות נפוצות בנושאי ביו-פרמה
Chapters in this video
0:05
Title
11:21
Conclusion
10:03
Results: Intersegmental Nerve Bundle (ISNb) Innervation at A3 and A4
0:48
Preparation of Late-stage Embryos for Immunostaining
4:19
LacZ Staining and Immunostaining
7:20
Preparing Embryos to Image the ISN Nerves in Abdominal Segments 7 to A9
