פרוטוקול למדידת Cue תגובתיות במודל של עכברים של הפרעה לשימוש בקוקאין

בפרוטוקול זה, תגובתיות לרמזים (cue reactivity) מודדת את המוטיבציה של בעל חיים לחפש קוקאין לאחר תקופה ללא הגשה עצמית של קוקאין. תגובתיות לרמזים מתרחשת כאשר החולדה נחשפת מחדש להקשר ולרמזים שהיו קשורים בעבר להזרקת קוקאין תוך-ורידית. תגובתיות לרמזים מהווה מדד לסיכון להישנות (relapse).

פרוטוקול התגובתיות לרמז המתואר כאן הוא אמצעי פרה-קליני לבדיקת תרופות המשנות את תהליך ההישחח (relapse), וכן לחקירת גורמים גנטיים וסביבתיים התורמים לסיכון להישחח. זוהי משימה אופרנטית להתנהגות של חיפוש סמים התואמת תכונות רבות של נטילת סמים והישחח בבני אדם. בוצעו אופטימיזציות לפרמטרים מרכזיים כגון מינון cocaine, נפח ההגשה ומשך האינפוזיה כדי לבסס את תוקף השלב (phase validity) ואת כוח התרגום היישומי.

עבור פרוטוקול זה, השתמש בחולדות Sprague Dawley זכרים בנות שמונה עד תשעה שבועות בקירוב, אשר עברו אקלמיזציה בחדר הגידול למשך שבעה ימים לפחות. במהלך תקופת האקלמיזציה, השכן את החולדות בזוגות וטפל בהן מדי יום לאורך כל המחקר. ספק גישה בלתי מוגבלת למזון בכלובי הבית שלהן בכל שלבי המחקר.

השתילו קטטרים בווריד הג'וגולרי (jugular vein) באמצעות השיטה שפורטה על ידי Kmiotek ועמיתיו בסרטון ה-JoVE שלהם, ולאחר מכן חלקו את החולדות באופן אקראי לקבוצות טיפול של תמיסת מלח (saline) או קוקאין. לצורך האימון, תכננו לוחות זמנים למתן עצמי של קוקאין כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. ציידו את תאי האימון בשני מנופי תגובה נסוגים, נורית גירוי מעל כל מנוף תגובה, ונורית בית מול המנופים.

הזרק קוקאין או תמיסת מלח באמצעות משאבות הזרקה ממזרקים הממוקמים מחוץ לתא. השתמש במחטים בכיול 23 gauge המחוברות למזרקים ובצינורות פוליאתילן העטופים בקפיץ מתכת המחוברים לקטטרים של החולדה. קוקאין או תמיסת מלח יוגשו לאחר לחיצה על המנוף הפעיל, אך לא לאחר לחיצה על המנוף הבלתי פעיל.

יש להחליף את התמיסות מדי יום. השתמשו בדילול קוקאין שהוכן טרי בתמיסת sodium chloride 0.9% סטרילית, המותאמת למשקלו של כל חולדה. טענו לפחות שמונה מיליליטר של תמיסה לתוך המזרק של כל חולדה.

התחילו באימון החולדות בלוח חיזוקים מסוג FR1 ועברו ללוח FR5 לאחר שלושה ימים רצופים של שבע הזרקות לשעה, עם שונות של פחות מ-10% במספר ההזרקות הכולל לניסוי. חובה לנתח את נתוני התנהגות ההזרקה העצמית על בסיס יומי כדי לקבוע מתי להעביר את החיה ל-FR5 וכדי לבדוק אם חלה פגיעה בפתוחות הקטטר. אחד השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול הוא ניטור ההזרקה העצמית במהלך 14 ימי האימון הראשונים כדי להבטיח שהחיה מבצעת הזרקה עצמית באופן תקין.

אם קצב ההגשה העצמית יורד באופן דרמטי, סביר להניח שהקטטר של החולדה איבד את הפתוחות שלו. בתחילת הסשן, ודאו שאין בועות במזרק. חברו את המזרק לצינור הפוליאתילן והכניסו אותו למשאבת ההזרקה.

כווננו בזהירות את המזרק כך שהתמיסה תהיה מפוזרת באופן אחיד ומלא בצינור הפוליאתילן. לאחר מכן, חברו את החולדות למערכת ההגשה והכניסו אותן לתאי התניה אופרנטית סטנדרטיים, השוכנים בתאים מאווררים ומבודדי רעש עם מאווררים. עקביות לאורך כל הניסוי היא חיונית.

יש להניח את החולדה תמיד באותה תא ולהשאיר את המנוף הפעיל באותו צד בתוך התא. במהלך 14 מפגשים יומיים של 180 דקות, לחולדות יש גישה חופשית למנופים והן ילמדו במהירות איזה מנוף מספק גירוי, בתנאי שהמערכת פועלת. כל הפעלה של המנוף הפעיל בלוח זמנים של יחס קבוע של אחד משחררת 0.1 milliliters של תמיסה במשך שש שניות, ובמקביל מדליקה את תאורת הכלוב ואת נורת הגירוי שמעל המנוף הפעיל.

קיימת השהיה של שנייה אחת לפני שחרור התמיסה. לאחר כל הזרקה של קוקאין או תמיסת מלח, אור הגירוי ומשאבת ההזרקה מושבתים למשך 20 שניות, שבמהלכן אור החדר נשאר דולק ולחיצה על המנוף אינה גורמת לתגובה אך נרשמת. כאשר האור נכבה, המנוף מופעל מחדש.

כל הפעלה של המנוף הלא-פעיל אינה גורמת לתוצאות מתוכננות. בתום סשן זה, הנמשך 180 דקות, הוצאו את החולדה, שעלולה להיות תוקפנית, מהתא בתנועות איטיות וזהירות. לאחר מכן, בצעו שטיפה לקטטר שלה.

בין המפגשים, יש לנקות את התאים בקפידה. נגבו כל משטח עם תמיסת ethanol 70%. בסיום מפגשי האימון, העבירו את החולדות לתקופה של היגמלות כפויה למשך 30 ימים, ללא גישה לתא האופרנטית.

המשיכו לטפל בחולדות על בסיס יומי ולנטר את מצבן הבריאותי הכללי. לאחר תקופת ההימנעות הממושכת, אפשרו לחולדות שהות של 60 דקות בתא האופרנט, ולאחריה מיד בצעו קציר של המוח. עבור מפגש זה, הפעילו את התוכנית המתוכננת לתגובתיות לרמז (cue reactivity).

דרגו את זמני תחילת המפגשים כדי לאפשר זמן לקציר המוחות בין המפגשים. חשוב להפעיל את המשאבה ללא המזרק המחובר, כך שהרמז השמיעתי של המשאבה עדיין יהיה חלק מהגירוי ללא אספקת החומר. התחילו מפגש זה כרגיל עם החולדה בתא ההגשה העצמית שבו היא אומנה.

בבדיקה זו, כאשר המנוף הפעיל שסיפק בעבר קוקאין או סליין נלחץ, רק הרמזים מוגשים בלוח זמנים של FR1. המנוף הבלתי פעיל עדיין אינו גורם לתגובה. רשמו את כל הצגת הרמזים, לחיצות המנוף שהיה פעיל בעבר ולחיצות המנוף הבלתי פעיל, וכן את השהיית הזמן עד ללחיצה הראשונה במנוף.

תוך שימוש בפרוטוקול המתואר, נערך מחקר שבו חוללים חולקים באופן פרטני מ-FR1 ל-FR5 ברגע שעמדו בקריטריונים. בקבוצה שקיבלה קוקאין, הגברת החולקים בהדרגה את מספר ההזרקות עד שהגיעו לקריטריון, ולאחר מכן הועברו מ-FR1 ל-FR5. מדדי פלט מרובים נאספו ממבחן התגובתיות לרמז של קוקאין.

לדוגמה, חולדות שהעניקו לעצמן קוקאין בעבר לחצו על המנוף שהיה פעיל קודם לכן הרבה יותר מחולדות שהעניקו לעצמן סליין. מדד פלט חשוב נוסף הוא הזמן עד ללחיצה הראשונה על המנוף (latency). כאשר נצפית תגובה שונה במדד זה, ייתכן שהבעל חיים נמצא תחת עקה פיזית או שרמת המוטיבציה שלו להענקה עצמית של קוקאין פחתה.

ניתן להשתמש במטלות התנהגות מוטורית כדי להעריך שינויים בבריאות הפיזית ולהבדיל בין ליקוי מוטורי לבין שינויים מוטיבציוניים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן אימון חולדות למתן עצמי של תרופה, שמירה על פתוחות הקתטר במהלך המתן העצמי, והערכת תגובתיות לרמזים המקושרים לתרופה לאחר תקופה של הימנעות, כמדד לסיכון להזרה.

בעקבות הליך זה, ניתן להעריך את המנגנונים התאיים והמולקולריים המניעים תגובתיות לרמזי קוקאין, וכן לבחון תרופות פוטנציאליות המשנות תגובתיות זו.