ODLAY: שיטה בקנה מידה גדול עבור כימות רב פרמטר של גידול שמרים
3 ביולי 2017
אנו מציגים שיטה לכימות פנוטיפים הצמיחה של תאים שמרים בודדים כפי שהם גדלים לתוך מושבות על מדיה מוצקה באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופ בשם, אחת הכפלה הערכה של מערכים חיים של שמרים (ODELAY). הטרוגניות האוכלוסייה של תאים זהים גנטית גדל לתוך מושבות ניתן לצפות ישירות לכמת.
המטרה הכוללת של ODELAY היא למדוד פנוטיפים של גדילה של תאים בודדים הגדלים למושבות בצורה בעלת תפוקה גבוהה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במיקרוביולוגיה, גנטיקה וביולוגיה מערכתית כגון ההשפעות של הפרעות גנטיות ואינטראקציות תרופתיות על פנוטיפים של גדילה של כל מיקרואורגניזם היוצר מושבה. היתרון העיקרי של ODELAY הוא בכך שהוא מאפשר לחוקר להתבונן ולכמת באופן ישיר הטרוגניות של אוכלוסייה בקרב מספר רב של פרטים.
לפני הרכבת תבנית האגר יש לנקות את תבניות האקריליק באתנול 70% ולייבש אותן באמצעות אוויר מאולץ. יש שלושה חלקים תחתונים ושני חלקים זקופים. כדי להתחיל להרכיב את תבנית האגר, קחו את שלושת החלקים התחתונים והרכיבו אותם כך ששני החלקים הזהים יכריכו את החלק השלישי.
השתמש בשני קליפסים קלסר קטנים כדי clamp חלקי הבסיס מכל צד. הנח את הזקפים לתוך התבנית וודא שעקומת הלייזר ממוקמת נכון. הניחו מגלשת זכוכית נקייה ומיובשת על התבנית והחזיקו אותה במקומה תוך הנחת מגלשת זכוכית שנייה בצד השני.
מהדק את המכלול עם קליפ קלסר גדול יותר. מהדק את שתי השקופיות עם קליפס קלסר גדול יותר וודא שכל קליפ קלסר עליון נמצא במגע עם מגלשת הזכוכית החופפת את האקריליק. לפני מילוי התבנית המורכבת באגר מותך, ודא שהקצוות אטומים על ידי פיפטינג של כ-70 מיקרוליטר של מדיה אגר מותכת לאורך הצד הפנימי של התבנית.
מלאו את התבנית מבלי ללכוד בועות אוויר בפנים על ידי פיפטינג איטי של האגר המותך לאורך קצה התבנית. לאחר מילוי התבנית, הניחו לה להתקרר בטמפרטורת סביבה של כ-23 מעלות צלזיוס למשך 40-60 דקות. השלב הבא הוא הפרדת עובש.
התחל בהסרת קליפ הקלסר התחתון. לאחר מכן הסר את החלק התחתון של התבנית המורכב משלושת החלקים הסנדוויץ'. החזק את השקופיות על ידי דחיסתן ולאחר מכן הסר את תפסי הקלסר בזהירות.
מניחים את התבנית על קצה הספסל כך שצד התבנית עם הנקודה הכחולה פונה כלפי מעלה. מניחים את שני האגודלים מתחת לאקריליק ואת האצבעות הראשונות בחלק העליון לכיוון הקצה הפנימי של התבנית ודוחפים לאט ובזהירות כלפי מעלה עם האגודלים כנגד התבנית כאילו מסובבים את מרווח התבנית סביב הקצה התחתון שלה. הפעל לחץ קבוע אך הולך וגובר לאט.
הפסקה ובועת אוויר אמורות להופיע לאורך קו שבו הזכוכית העליונה מכסה את מרווח התבנית. לאחר שראית את קו השבירה הראשוני, המשך לדחוף למעלה עם שני האגודלים ולהפעיל לחץ מתמיד. האגר צריך להתחיל להתנתק מהזכוכית.
המשיכו לסובב את התבנית כלפי מעלה. כשהזכוכית מגיעה חופשית לחלוטין, תפסו אותה והוציאו אותה לחלוטין מהתבנית. לאחר מכן הסר את חתיכת התבנית השנייה בתנועה דומה כדי להרים את הנתח לחופשי מבלי להזיז את האגר.
הנח את המגלשות בקופסת קצה סטרילית עם מעט מים סטריליים בטוהר גבוה בתחתית. סוגרים את הקופסה ומאחסנים בחום של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה לשימוש למחרת. התחל הליך זה על ידי הכנת הזנים בצלחת 96 בארות כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
שימוש בקורא צלחות למדידת הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר של כל תרבית. לאחר מכן השתמש בפרוטוקול דילול אוטומטי כדי לדלל את התרביות בצלחת לצפיפות אופטית של 600 ננומטר של כ-0.1. לאחר הגדרת תוכנית הדילול יש להציב לוחות עומס, צינורות וטיפים על סיפון הרובוט לטיפול בנוזלים כפי שמצוין בפריסת הסיפון.
לחץ על כפתור ההפעלה כדי להפעיל את תוכנית הדילול. בחר את המספר הנכון של 50 קצות מיקרוליטר ואת המספר הנכון של 300 טיפים מיקרוליטר. בסיום הדילול, הסר את צלחת הדילול מהרובוט ותרבית את הצלחת ב-30 מעלות צלזיוס תוך שמירה על הלחות כדי למנוע התייבשות של הצלחת למשך חמש עד שש שעות.
כשעה עד שעתיים לפני השלמת הדגירה של לוחית התרבית, הפעל את תאי הדגירה למיקרוסקופ ואפשר להם להתייצב ב-30 מעלות צלזיוס. לדלל את התרבית פעם שנייה לצפיפות אופטית ב-600 ננומטר של 0.01 עד 0.02 באמצעות אותו פרוטוקול דילול אוטומטי. מכסים את צלחת הדילול באטם מקפיא מתכתי וסוניקט באמבט קרח למשך 30 שניות כשהצלחת צפה במי קרח.
סמן ארבע צלחות תחתונות שטוחות 96 היטב כאחת, שתיים, שלוש וארבע. העבירו 150 מיקרוליטר מכל תרבית סוניקטיבית מצלחת הדילול לצלחות התחתונות השטוחות בהתאם לדפוס זה. בארות A1 עד D6 לבארות C4 עד F9 בלוח 1.
בארות A7 עד D12 לבארות C4 עד F9 של לוח שתיים. בארות E1 עד H6 לבארות C4 עד F9 בלוח שלוש. ובארות E7 עד H12 לבארות C4 עד F9 של לוח ארבע.
כדי להתחיל בהליך זה, הנח את מגלשת האגרוז בצורה נכונה לתוך תא השקופיות. לאחר מכן, הניחו את 96 הצלחות התחתונות השטוחות היטב על השולחן לפי סדר הרבע שלהן. לוחות 1, 2, 3 ו-4 משמאל לימין.
פרשו טיפים בארבע קופסאות טיפים ריקות כך ש-24 הבארות הפנימיות של כל קופסת טיפים יהיו תפוסות בקצוות. בתיבה חמישית, הנח קצה במצב C10 וקצוות כשקצותיהם חתוכים במיקומים A1, A12, H1 ו-H12. ארבעת הקצוות החתוכים הללו יספקו יציבות ללוחית הקצה clamp.
הנח את אגרוף הקצה הראשון באתר ההתחלה של תוכנית האיתור של בקרת הרובוט כדי לנקב חור באגרוז שישמש מאוחר יותר ליישור קואורדינטת המקור. הנח את צלחת אחת על הרובוט לטיפול בנוזלים כדי לזהות את הרביע הראשון. הסר את המכסה והמשך בתוכנית האיתור.
בדוק כדי לוודא שכל הכתמים קיימים. רוקן את הקצוות המשומשים לתוך מיכל הסכנה הביולוגית והנח טיפים טריים על הרובוט. המתן כ-30 שניות עד שהכתמים יתייבשו לקוטר של כמילימטר אחד ולאחר מכן המשך בתוכנית.
החלף את צלחת אחת בצלחת שתיים והמשך בתוכנית האיתור. כאשר כל ארבעת הרבעים זוהו והכתמים יבשים, החלף את מכסה תא ההחלקה והפוך את המכשיר. הנח מגלשת זכוכית בצד העליון של תא השקופיות.
ראשית טען את תא השקופיות למיקרוסקופ. מיקרוסקופ זמן-lapse מתבצע על ידי הפעלת סקריפט מעוצב בהתאמה אישית. לחץ על התריס כדי לפתוח את תריס האור המועבר ולאחר מכן על כפתור המיקוד כדי להפעיל את קצב המצלמה הגבוה.
לחץ על Go Origin"והזז את הבמה כדי למצוא את סימן המקור שנקב באגר ואז זז מעט ימינה כדי להתמקד בתאים שזוהו באזור E7. חזור לאגרוף המקור ומרכז אותו בשדה הראייה. הגדר את המקור לערך זה על ידי לחיצה על כפתור הגדר. עבור למצב H18 והתמקד באמצעות בורג המשושה הקרוב ביותר למיקום זה.
לאחר מכן עבור למצב L7 והתמקד באמצעות בורג המשושה הקרוב ביותר למיקום זה. לבסוף עברו למצב E7 והתמקדו באמצעות בורג המשושה הקרוב ביותר למיקום זה. בדוק את המיקוד במרכז ובקצוות בנקודות E12, H12 ו-L12 התאם את טווח המיקוד האוטומטי אם ערכי המיקוד z כפי שמצוין על ידי ערך z גדולים מ-פלוס או מינוס טווח המיקוד האוטומטי.
לחץ על כפתור האיפוס ולאחר מכן לחץ על ODELAY. בחר את הספרייה לשמירת הנתונים. המיקרוסקופ יאסוף נתונים במשך 48 שעות או עד לסגירת התוכנית.
תמונות מייצגות אלה מציגות תאי שמרים הגדלים על מדיום מוצק כשעת אפס, שלוש שעות, שש שעות ותשע שעות לאחר האיתור. מוצג כאן מערך נתונים מייצג המשווה בין שני זני שמרים לאחר עיבוד תמונות ה-Timelapse. זמני ההכפלה האחידים יחסית משקפים את שקופית האגרוז המוכנה היטב, אולם זמני ההשהיה משתנים במידה ניכרת עקב הגדרות פוקוס אוטומטי שאינן אופטימליות.
מערך נתונים עקבי יותר מוצג כאן שבו נראה שכל זמני ההכפלה חופפים היטב וזמני ההשהיה נראים עקביים. לאחר שליטה, ניתן לבצע את ההתקנה של ODELAY תוך שלוש עד ארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי. השלבים הקריטיים ביותר למדידות ODELAY חוזרות הם הכנת המדיה באופן עקבי והימנעות מעיוות מכני של המדיה תוך הפרדת השקופיות.
ODELAY היא בדיקה רגישה מאוד. לדוגמה, הוא יכול להבחין בפגמי גידול בזני שמרים רגישים לטמפרטורה בטמפרטורת החדר, כאשר בדיקות נקודתיות נפוצות דורשות גידול שמרים ב-37 מעלות צלזיוס כדי לחשוף פגם בגדילה. בעוד ש-ODELAY פותחה בשמרים, השיטה ישימה לכל אורגניזם יוצר מושבה כולל פתוגנים כדי לחקור מגוון רחב של תנאים סביבתיים וגנטיים כדי להבין את התנהגותם של מיקרואורגניזמים.
לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע ODELAY כדי למדוד פנוטיפים של גדילה של מיקרואורגניזמים חד-תאיים היוצרים מושבות על מדיה מוצקה. אל תשכח שעבודה עם מיקרואורגניזמים עלולה להיות מסוכנת ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן אישי המתאים לאורגניזמים הנחקרים.
סקירה כללית
שיטת ODELAY מאפשרת כימות של פנוטיפי גדילה בתאי שמרים בודדים בעודם מתפתחים למושבות על מצע מוצק באמצעות מיקרוסקופיה של צילום רצף (time-lapse). טכניקה זו מקלה על התצפית ומדידה של ההטרוגניות האוכלוסין בין תאים זהים גנטית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה
- גנטיקה
- ביולוגיה של מערכות
רקע
- הטרוגניות של האוכלוסייה עשויה להשפיע באופן משמעותי על תוצאות הגדילה במושבות מיקרוביאליות.
- הבנת פנוטיפי הגדילה חיונית להשגת תובנות לגבי השפעות גנטיות וסביבתיות.
- מיקרוסקופיה של צילומי lapsed-time מספקת מבט דינמי על גדילת תאים ואינטראקציות ביניהם.
- ODELAY מציעה גישה בעלת תפוקה גבוהה לחקר מיקרואורגניזמים היוצרים מושבות.
מטרת המחקר
- למדידה ולכימות של פנוטיפי גדילה של תאי שמרים בודדים.
- לבחינת ההשפעות של הפרעות גנטיות על גדילת התאים.
- לחקירת אינטראקציות בין תרופות והשפעתן על גדילה מיקרוביאלית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תבניות אגר לתרבית שמרים.
- מיקרוסקופיה בשיטת Time-lapse לצפייה בצמיחת תאים.
- פרוטוקולי דילול אוטומטיים לסטנדרטיזציה של ריכוזי תאים.
- שימוש ברובוטים לטיפול בנוזלים לעיבוד דגימות בספיקת גבוהה (high-throughput).
תוצאות עיקריות
- הרכבה ושימוש מוצלחים בתבניות אגר לצמיחת שמרים.
- כימות של פנוטיפי צמיחה חשף הגויה אוכלוסיות משמעותית.
- הוכח כי ניתן לתצפת על השפעות של אינטראקציות גנטיות ותרופתיות על הצמיחה.
- מתודולוגיה בthroughput גבוה הגבירה את היעילות באיסוף הנתונים.
מסקנות
- ODELAY היא שיטה יעילה לחקר פנוטיפים של צמיחת שמרים.
- הטכניקה משפרת את ההבנה של דינמיקת אוכלוסיות מיקרוביאליות.
- יישומים עתידיים עשויים להתרחב למיקרואורגניזמים אחרים היוצרים מושבות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מדידה כמותית רב-פרמטרית של פנוטיפים של צמיחה מיקרובית היא קריטית להפחתת סיכונים בהשערות לגבי יעדים גנטיים ולהבנת ההטרוגניות של האוכלוסייה בשלבי הגילוי המוקדמים. ODELAY מאפשרת ניתוח בעל תפוקה גבוהה עם רזולוציית זמן של צמיחת תאים בודדים, ובכך תומכת בתיקוף יעדים חסון ובהבנה מכניסטית. יכולת זו מחזקת את הביטחון החזוי בנקודות מפתח של תהליכי גנטיקה מיקרובית וגנומיקה תפקודית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר כימות ישיר של פנוטיפי צמיחה לאורך שלבי הלג, הלוג והשלב הסטציונרי לצורך חקירה של מטרות פונקציונליות.
- חושף הטרוגניות באוכלוסייה, דבר התומך בהסרה של סיכונים מכניסטיים ובבירור של מסלולים גנטיים.
- מסייע בהערכת השפעות של הפרעות גנטיות וסביבתיות על כשירות מיקרוביאלית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין בדיקות צמיחה כמותיות ומאומתות עבור תהליכי סינון המשכיים.
- תומך בשחזור ובסטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות טיפול מדגמים והדמיה אוטומטיים.
- מייצר נתונים בעלי תוכן גבוה ורזולוציה זמנית, המתאימים להכנה לסריקות של תרכובות או סריקות גנטיות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מאפשר מידול של תגובות אוכלוסיות מיקרוביאליות לשינויים גנטיים או סביבתיים הרלוונטיים למצבים מחלה או למסגרות תעשייתיות.
- תומך ברצף מהשלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי אספקת נקודות סיום פנוטיפיות כמותיות ורובסטיות.
- משפר החלטות קידום מותאמות סיכון על ידי הבהרה של השונות הביולוגית וספי סף של תגובה.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
ODELAY משתלב ברצף השלב שבין הגילוי המוקדם לזיהוי מובילים, ומספק פלטפורמה ניתנת להרחבה לבדיקת היפותזות ולפיתוח בדיקות במערכות מיקרוביאליות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערת האפס ובניתוח מסלולים על ידי כימות תגובות גדילה לשינויים גנטיים או סביבתיים.
- סריקה: מספקת מדדי גדילה כמותיים הניתנים לשחזור לצורך סטנדרטיזציה של בדיקות ויכולת הרחבה של הסריקה.
- אנליטיקה: מספקת מדידות רב-פרמטריות בעלות רזולוציית זמן המאפשרות השוואה סטטיסטית של תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מתאימה פלט פנוטיפי לדרישות של מודלים פרה-קליניים בעת חקר מיקרואורגניזמים הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה בעלת תפוקה גבוהה וניתנת לשימוש חוזר, הניתנת להתאמה למיקרואורגניזמים מגוונים היוצרים מושבות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה של בדיקות צמיחה.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) ויעילות הון על ידי הבהרת הסיכון הביולוגי בשלב מוקדם.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף וקידום של מטרות או התערבויות מיקרוביאליות מותאם סיכון.
שיקולים ליישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה של צילום רצף (time-lapse), גנטיקה מיקרוביאלית וניתוח נתונים כמותי.
- נדרש גישה למערכות אוטומטיות לטיפול בנוזלים, תשתית דימוי ואחסון נתונים חסון.
- דורש סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים להכנת מצעים ולהגדרת הבדיקה (assay).
- ניתן להתאמה למיקרואורגניזמים שונים היוצרים מושבות הנראים במיקרוסקופיה בשדה בהיר (bright field).
- קריטי למנוע עיוות מכני של המצעים ולהבטיח תנאים סביבתיים עקביים לצורך שחזור התוצאות.
