Vascularized Microfluidic Bioprinting עבור הנדסת רקמות, Organoids

המטרה הכוללת של מתודולוגיית הדפסה ביולוגית מיקרופלואידית זו, היא ליצור מבנה רקמה כלי דם. שיטה זו יכולה לפתור שאלות מפתח בייצור ביולוגי של רקמות כלי דם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא רב-תכליתית ביצירת מיכל כלי דם מבוקר צורה תלת מימדית להנדסת רקמות כלי דם בתהליך זריעת תאים משני.

למרות שפרוטוקול זה מספק תובנה לגבי הנדסת רקמות לב כלי דם, ניתן ליישם אותו גם על סוגי רקמות רבים אחרים כגון כבד, עור ואפילו סרטן. אנשים כלליים החדשים בשיטה זו עשויים להתקשות מכיוון שהגדרת המדפסת הביולוגית עשויה להיות לא פשוטה. כדי להתחיל בהליך זה, בנה ראש הדפסה מיקרופלואידי קונצנטרי דו-שכבתי על ידי הכנסת מחט קהה קטנה יותר, המשמשת כליבה, למרכז המחט הקהה הגדולה יותר, המשמשת כנדן.

ודא שמחט הליבה בולטת מהמעטפת החיצונית כמילימטר אחד. לאחר מכן הכנס מחט בגודל 23 לקנה של המחט המרכזית בכיוון ההפוך. צור חור בצד הקנה של המחט החיצונית והכנס מחבר מתכת בגודל תואם.

חותמים עם דבק אפוקסי. התקן את המכבש על ראש מדפסת ביולוגית, באמצעות מחזיק פולימתיל מתאקרילט או PMMA. לאחר מכן להזרקת הדיו הביולוגי ותמיסת הקישור דרך שני צינורות PVC בנפרד, חבר את כניסות ראש ההדפסה למשאבת מזרק דו-ערוצית.

הכינו את הדיו הביולוגי באמצעות תערובת של אלגינט, gelMA ופוטו-יוזם. מומס במאגר HEPES של 25 מילי-מולרי, המכיל 10% סרום בקר עוברי או FBS. לאחר מכן הכינו תמיסה של 0.3 סידן כלורי מולארי במאגר HEPES המכיל 10% FBS כדי לשמש כנוזל הנשא המקשר.

ממש לפני ההדפסה הביולוגית, נסה תאי אנדותל של וריד הטבור האנושי או HUVECs למשך חמש עד 10 דקות. צנטריפוגה של התאים ב-800 סל"ד למשך חמש דקות בשפופרת של 15 מיליליטר. השעו מחדש את התאים בדיו הביולוגי בריכוז של חמש עד 10 פעמים 10 עד ששת התאים למיליליטר על ידי פיפטינג איטי חמש עד 10 פעמים.

לאחר מכן השתמש במשאבת מזרק דו-ערוצית כדי להתחיל בהזרקת הדיו הביולוגי של HUVECs דרך אחד, ואת נוזל הקישור דרך התעלה השנייה בקצב זרימה של חמישה מיקרוליטר לדקה. אפשר לזרימות לפעול ברציפות עד דקה אחת עד שהן מתייצבות. לאחר מכן התחל את תנועת ראש ההדפסה על ידי שמירה על מהירות שקיעת התצהיר של המדפסת הביולוגית של כארבעה מילימטרים לשנייה.

הדפסה ביולוגית זו אמורה לגרום לג'לציה יונית מהירה של רכיב האלגינט ולשקיעה של פיגום מיקרופייבר. לאחר הדפסת הפיגום, הצליב את רכיב ה-gelMA עם חמישה עד 10 מילי-וואט לסנטימטר רבוע של אור UV למשך 20 עד 30 שניות כדי להשיג ג'לציה כימית. לאחר מכן הסר את עודפי הסידן הכלורי מהפיגום על ידי שטיפה עדינה עם PBS חם של 37 מעלות צלזיוס.

תרבית פיגום זה במדיום גידול תאי אנדותל ב-37 מעלות צלזיוס בחמישה אחוזי CO2 בנפח, עד 16 יום. החלף את המדיום לפחות כל יומיים. במהלך תקופת התרבית, עקוב אחר ה-HUVECs תחת מיקרוסקופ עד שהם נודדים לשוליים של מיקרו-סיבי הפיגום ויוצרים מבנים דמויי לומן.

לאחר מכן הסר בזהירות את כל המדיום מהחלל התוך-תאי של הפיגום בכוח נימי באמצעות פיסת נייר פילטר סטרילי. הוסף באופן מיידי טיפת תרחיף מסוג תא משני כגון קרדיומיוציטים על גבי הפיגום, מה שמאפשר לתאים לחדור לכל החלל התוך-תאי לאחר מכן דגרו את הפיגום הזה בחממה למשך 30 דקות עד שעתיים, מה שמאפשר לתאים להיצמד למיקרופייבר הבודד.

הסר תאים שאינם נדבקים על ידי שטיפת הפיגום בעדינות עם PBS. תרבית פיגום זה במדיום מתאים עד שנוצרת רקמת כלי הדם הרצויה. הדפסה ביולוגית מיקרופלואידית המתוארת כאן, מאפשרת הדפסה ביולוגית ישירה של פיגומים מיקרוסיביים באמצעות דיו ביולוגי בעל צמיגות נמוכה.

פיגום בגודל שישה על שישה על שישה מילימטרים רבועים < המכיל יותר מ-30 מיקרופייבר, יכול להיות מודפס ביולוגית תוך 10 דקות. מראות עליונים וצדדיים של מיקרוגרפי פיגומים מראים את השלמות המבנית המצוינת במהלך תהליך ההדפסה הביולוגית. מושג עם קישור יוני מיידי של רכיב האלגינט עם סידן כלורי.

לאחר שחול מיקרופלואידי של הדיו הביולוגי, קישור צולב יוני וקישור צולב צילום, HUVECs שמרו על כדאיות גבוהה יחסית. התאים התרבו ונדדו מההתפלגות האקראית הראשונית ביום האפס, לפריפריות של המיקרופייבר ביום ה-16. קרדיומיוציטים של חולדות יילודים שנזרעו על הפיגום הבשילו ואכלסו את הפיגום.

הם הראו ביטוי חזק של סמנים ביולוגיים לבביים תפקודיים. כגון סרקומרי אלפא אקטינין, וקונקסין 43. מיקרוסקופיה קונפוקלית של פיגום מיקרו-סיבי מודפס ביולוגית, המאוכלס בקרדיומיוציטים, חשפה דו-קיום של HUVECs וקרדיומיוציטים.

HUVECs קיימים בעיקר בגבולות המירקופייבר, ואילו הקרדיומיוציטים מקיפים את החלק החיצוני של המיקרופייבר. התאים הצליחו לשמור על פעימתם הספונטנית והמסונכרנת עד תשעה עד 28 ימים. תלוי במקור התא ובתצורת הפיגומים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לייצר רקמות כלי דם באמצעות טכניקת הדפסה ביולוגית מיקרופלואידית, כמו גם ייצור ראש הדפסה ופעולות מדפסת ביולוגית. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שייצור ראש ההדפסה ופעולות המדפסת הביולוגית עשויות להיות מסובכות עבור אנשים שלא השתמשו בה בעבר. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להפוך את שתי המחטים לקונצנטריות בראש ההדפסה ולתת לזרימה להתייצב לפני תחילת ההדפסה הביולוגית.

עם התפתחות טכניקה זו, לחוקרים בתחום הנדסת רקמות וייצור ביולוגי יש כעת כלי נוסף המאפשר ליצור מבני רקמות כלי דם למטרות התחדשות in vivo או למידול רקמות במבחנה.