דור של כרומטין יליד Immunoprecipitation רצף ספריות לניתוח צפיפות נוקלאוזום

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור ספריות ריצוף חיסון מקוריות של כרומטין לניתוח צפיפות נוקלאוזום. שיטה זו יכולה לענות על שאלות באפיגנטיקה כגון חשיפת תכונות אפיגנומיות באוכלוסיית תאים ברמת נוקלאוזום בודד ופתרון חתימות כרומטין הטרוגניות לאלמנטים הרציפים שלהם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שימוש במאפיין MNase של גישה מועדפת לאזור כרומטין פתוח כדי ליצור מדידה המשלבת נגישות MNase עם שינוי היסטון.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהם אינם מסוגלים להשיג עיכול MNase אופטימלי. התחל פרוטוקול זה בהכנת תאים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. ביום הראשון, הפשירו כל כדור תא באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות.

לאחר מכן, העבירו את התאים לקרח. לכל כדור תא, הוסף מיד מאגר ליזה 1-X קר כקרח בתוספת 1-X PIC לריכוז סופי של 10,000 תאים ל-20 מיקרוליטר. מערבבים 10 פעמים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מבלי ליצור בועות.

בעבודה על קרח, מכסים 20 מיקרוליטר לבאר מהליזטים המתקבלים לצלחת של 96 בארות. מכסים את הצלחת בחותם הפלסטיק לפני הדגירה על קרח למשך 20 דקות. סמן את הצלחת כ-MNase ורשום את הבארות למפתח תבנית.

רגע לפני השלמת הליזה של 20 דקות, יש לדלל את האנזים MNase one עם מאגר דילול אחד של MNase לריכוז סופי של 20 יחידות למיקרוליטר ולשמור אותו על קרח. בעבודה על קרח, הכינו את תערובת מאסטר העיכול של MNase אחד כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, ציטטו 20 מיקרוליטר מתערובת המאסטר לכל שורת דגימות, בתוספת חמישה מיקרוליטרים של נפח נוסף לתוך צלחת מאגר של 96 בארות.

לאחר סיום הדגירה של הליזאטים, הסר את צלחת העיכול MNase מהקרח. בעזרת פיפטה רב-ערוצית, הוסף 20 מיקרוליטר של MNnase תערובת מאסטר לעיכול אחד לכל שורת דגימות וערבב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10 פעמים. שנה את העצות בין השורות.

לאחר מכן, דגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות בדיוק. כדי לעצור את התגובה לאחר חמש דקות, השתמשו בפיפטה רב-ערוצית כדי להוסיף שישה מיקרוליטרים של EDTA של 250 מיקרו-מולרית לכל שורת דגימות ולערבב למעלה ולמטה כמה פעמים. הקפד להחליף טיפים בין השורות.

לאחר הוספת EDTA, החלף את הגדרת הפיפטה ל-20 מיקרוליטר, וערבב 10 פעמים כמו קודם כדי להבטיח עצירה מוחלטת של תגובת העיכול. לבסוף, הוסף שישה מיקרוליטרים של מאגר ליזה 10X לכל שורה של הדגימות המעוכלות של MNase וערבב היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10 פעמים. מכסים את הצלחת בחותם פלסטיק ודוגרים על קרח למשך 15 דקות.

הכן את צלחת מורכבת חרוזי הנוגדנים ואת צלחת הניקוי המקדים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. סובב במהירות את שתי הלוחות על ידי צנטריפוגה למשך 10 שניות ב-200 פעמים G.לאחר מכן, הנח את צלחת קומפלקס חרוזי הנוגדנים על מגנט צלחת והמתן 15 שניות עד שהתמיסה תתבהר. הסר בזהירות והשליך את הסופרנטנט באמצעות פיפטה מבלי להפריע לחרוזים.

לאחר מכן, הסר את הצלחת ממגנט הצלחת ושמור אותה על קרח. הנח את לוחית התגובה לניקוי מראש על מגנט צלחת והמתן 15 שניות עד שהחרוזים ייפרדו ושהתמיסה תתבהר. מבלי להפריע לחרוזים, השתמש בפיפטה כדי להעביר בזהירות את הסופרנטנט לבארות המתאימות של צלחת קומפלקס חרוזי הנוגדנים השמורה על קרח.

מערבבים כל היטב בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 15 פעמים. אוטמים היטב את הצלחת עם מכסה צלחת אלומיניום ודוגרים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס על פלטפורמה מסתובבת. לאחר הדגירה, סמן מחדש את הצלחת תגובת IP.

ביום השני, כוונו את מערבל החימום ל-65 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן הכינו מאגר כביסה דל מלח ומאגר כביסה עתיר מלח על קרח. סובב במהירות את לוחית תגובת ה-IP למשך 10 שניות ב-200 פעמים G.הנח את לוחית תגובת ה-IP על מגנט צלחת והמתן 15 שניות עד שהפתרון יתבהר. בעזרת פיפטה רב-ערוצית, מבלי להפריע לחרוזים, הסר בזהירות והשליך את הסופרנטנט.

הסר את הצלחת ממגנט הצלחת והנח אותה על קרח. לכל שורה של דגימות בצלחת תגובת ה-IP, הוסף 150 מיקרוליטר של מאגר כביסה דל מלח קר כקרח וערבב לאט למעלה ולמטה במשך 10 פעמים כדי להשעות מחדש את החרוזים במלואם. הנח את לוחית תגובת ה-IP בחזרה על מגנט הצלחת והסר את ה-supernatant כמו קודם.

לאחר מכן, הניחו את הצלחת בחזרה על קרח וחזרו על שלבי הכביסה בסך הכל שתי כביסות. בעבודה על קרח, הוסף 150 מיקרוליטר של מאגר הכביסה עתיר המלח לכל שורת דגימות בצלחת תגובת ה-IP. מערבבים את הדגימות לאט על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10 פעמים כדי להשעות את החרוזים במלואם.

לאחר הסרת הסופרנטנט כמו קודם, הניחו את לוחית תגובת ה-IP על קרח וצננו מראש צלחת חדשה של 96 בארות לצידה. לכל שורה של דגימות בלוחית תגובת ה-IP, הוסף 150 מיקרוליטר ממאגר הכביסה עתיר המלח וערבב לאט 10 פעמים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה כדי להשעות מחדש את החרוזים במלואם. לאחר ההשעיה מחדש, העבירו כל שורת דגימות לשורה המתאימה של צלחת 96 הבארות החדשה המצוננת מראש.

השלך את הצלחת הישנה. הנח את לוחית תגובת ה-IP החדשה על מגנט הצלחת והשליך את הסופרנטנט כמו קודם. שמור את הצלחת בטמפרטורת החדר.

לכל שורה של דגימות בלוחית תגובת ה-IP, הוסף 30 מיקרוליטר של מאגר הפליטה ChIP וערבב לאט על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10 פעמים. הקפד למנוע היווצרות בועות. אוטמים את הצלחת במכסה PCR ודוגרים במיקסר חימום בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך שעה וחצי במהירות ערבוב של 1, 350 סל"ד.

לאחר דגירה של שעה וחצי, סובב את לוחית תגובת ה-IP ב-200 פעמים G למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הנח את לוחית תגובת ה-IP על מגנט צלחת והמתן עד שהתמיסה תתבהר. בעזרת פיפטה רב-ערוצית, מבלי להפריע לחרוזים, העבירו בזהירות 20 מיקרוליטר של הסופרנטנט לצלחת חדשה של 96 בארות בעזרת טיפים טריים לכל שורה.

סמן את הצלחת תגובת IP ושמור אותה בטמפרטורת החדר. המשך לעיכול חלבון ואחריו בניית ספרייה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מוצגות כאן תוצאות מייצגות של כרומטין מעוכל MNase אופטימלי, לא מעוכל ומעוכל יתר על המידה לפני יצירת הספרייה.

הפרופיל המתעכל בצורה אופטימלית נשלט על ידי גדלי שברי נוקלאוזום בודדים בעוד שאינו מתעכל יתר על המידה כדי לאפשר התאוששות של מקטעי נוקלאוזום מסדר גבוה יותר. עיכול לא אופטימלי של כרומטין יהיה ניכר גם בפרופיל של ספריית הריצוף שנוצרה מחומר ה-IP. כדי לאמת את הספריות על ידי qPCR, העשרה מקופלת של ספריות IP ביחס לספריית הקלט הוערכה עבור יעדים חיוביים ושליליים.

בנוסף, בדיקה של הקריאות המיושרות של ספריות עם העשרת קיפול מוערכת qPCR גבוהה בדפדפן גנום אמורה לחשוף העשרה הניתנת לזיהוי חזותי בהשוואה לספריית הקלט. ספריות ריצוף ChIP מוצלחות בצפיפות נוקלאוזומים יכילו שכפולים בעלי קורלציה גבוהה עם חלק משמעותי של קריאות מיושרות בתוך פסגות מועשרות המזוהות עם MACS2. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך יומיים אם היא מבוצעת כראוי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור ספריות ריצוף מקוריות של כרומטין אימונו-משקעים לניתוח צפיפות נוקלאוזום. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לוודא שהכרומטין מתעכל בצורה אופטימלית ולהשתמש רק בנוגדנים המראים זיקה גבוהה לאפיטופ המעניין ומראים מעט או ללא תגובתיות צולבת עם אפיטופים אחרים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע מודלים חישוביים של נגישות MNase כדי לענות על שאלות כגון חתימות אפיגנטיות עקב הטרוגניות בתוך אוכלוסיית תאים.

שיטה זו מספקת תובנה לגבי ההשפעה הקומבינטורית של מיקום הנוקלאוזום והצפיפות המקומית, כמו גם שינוי לאחר התרגום של תת-יחידות ההיסטון שלהם וניתן ליישם אותה על כל מערכת כגון אדם או עכבר, תאים ראשוניים ורקמות קפואות.