אפיון נדידת תאים בתוך תלת מימדי במבחנה פצע סביבות

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבחון את ההשפעה של טיפולים ספציפיים מעניינים על נדידת תאים בפיגום פיברין הקשור לפצע תלת מימדי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ריפוי הפצעים, על האופן שבו שינויים במבנה רשת הסיבים משפיעים על נדידת התאים ועל קרישי פיברין באתרי פצעים, היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת שיטה פשוטה וניתנת לשחזור לניתוח נדידת תאים בתוך קרישי פיברין בתלת מימד. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהעברת הספרואידים יכולה להיות קשה.

התחל בחימום בקבוקון של פיברובלסטים עוריים אנושיים קפואים בילודים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. כאשר התאים רק מופשרים, אספו אותם על ידי צנטריפוגה והשעו מחדש את הגלולה במדיום פיברובלסטים עורי אנושי טרי בילודים בריכוז של 1 x 10 עד 6 תאים למיליליטר. לאחר מכן זרעו את התאים בבקבוק תרבית T75 למשך 72 שעות דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

כאשר התרבית מגיעה למפגש של 80%, נתק את התאים עם חמישה מיליליטר טריפסין EDTA. לאחר חמש דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס, נטרלו את הטריפסין עם חמישה מיליליטר של מדיום מחומם וערבבו 40 מיקרוליטר תאים עם טריפאן כחול ביחס של 1:1. שמור 10 מיקרוליטר של תאים לספירה.

אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה והשהה מחדש את הגלולה בריכוז של 1.25 x 10 עד 5 תאים למיליליטר. לאחר מכן, צלחו את החלק התחתון של צלחת פטרי בגודל 10 סנטימטר עם חמישה מיליליטר PBS סטרילי. לאחר מכן הפוך את מכסה צלחת הפטרי והוסף טיפות מרובות של 20 מיקרוליטר של תרחיף התאים על המשטח הפנימי של המכסה.

לאחר שכל הטיפות הונחו, החזירו את המכסה על הצלחת, הקפידו לא לעקור את הטיפות התלויות והניחו בעדינות את המנה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות. בתום הדגירה מוסיפים 100 מיקרוליטר תמיסת קריש לכל כדור לבאר, לצלחת של 48 בארות ומנערים בעדינות ומקישים על הצלחת כדי להבטיח שתערובת קרישי הפיברין מצפה את כל הבאר. מניחים את הצלחת בחממה למשך שעה.

כאשר שכבת הקריש התפלמרה, אשר את נוכחותם של ספרואידים בתרבית הטיפה התלויה, תחת מיקרוסקופ אור והעביר את צלחת 48 הבאר ואת צלחת תרבית הטיפה התלויה למכסה המנוע של תרבית תאים. הפוך בזהירות את מכסה צלחת הפטרי כדי לגשת לתרביות הטיפות התלויות והשתמש במזרק מיליליטר אחד המצויד במחט בגודל 21, כדי להעביר טיפה אחת לכל ציפוי פיברין היטב. אני נוקט משנה זהירות בעת שאיבת וציפוי הספרואידים, מכיוון שהשלב הקשה והקריטי ביותר בתהליך הוא העברת הספרואידים מבלי להשמיד אותם.

בדוק את הצלחת מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שהספרואידים נזרעו כראוי לבארות המתאימות. שכבו בעדינות 100 מיקרוליטר של תמיסת קרישים טרייה שהוכנה על כל טיפה המכילה ספרואיד ובחנו מחדש את הספרואידים תחת המיקרוסקופ, כדי לוודא שהם עדיין שלמים ובמרכז כל באר. לאחר מכן החזירו את צלחת 48 הבאר לחממה כדי לאפשר לשכבת הפיברין השנייה להתפלמר.

לאחר שעה, יש לטפל בכל באר ב -500 מיקרוליטר של המדיום המתאים לקבוצת הספרואידים הניסיונית המתאימה ולהחזיר את הצלחת לחממה של 37 מעלות צלזיוס. השג תמונות של הספרואידים על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר כל 24 עד 72 שעות, באמצעות מחסנית z כדי להציג חתכים עוקבים של תרבית התאים התלת מימדית. לאחר מכן, בתוכנת ניתוח התמונה המתאימה, עקוב אחר גבול התא של כל ספרואיד בכל נקודת זמן עוקבת והשתמש בפונקציית המדידה כדי לגשת לאחוז הגידול בשטח עבור כל ספרואיד.

לאחר התרבית שלהם, בחומר המעניין בעד או נגד נדידה, ניתן לקבוע את האזורים הראשוניים של הספרואידים על ידי הדמיה מיקרוסקופית בשדה בהיר ולהשתמש בהם כהתייחסות לקביעת מידת צמיחת התאים הבאים מגופי הספרואידים בכל נקודת זמן עוקבת. בניסוי מייצג זה, הספרואידים שנחשפו לחומר פרו-נדידה, הראו דרגה מוגברת משמעותית של נדידה הרחק מהגוף הספרואיד המקורי בהשוואה לספרואידים שנחשפו לחומר מעכב נדידה או בקרה. לעומת זאת, הספרואידים שנחשפו לחומר אנטי-נדידה הראו ירידה משמעותית בדרגת הנדידה הרחק מהגוף הספרואיד המקורי, בהשוואה לספרואידים שטופלו בביקורת.

לאחר השליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך שעתיים וחצי, למעט זמן תרבית התאים, אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתרבית ולהטמיע ספרואידים של תאים עבור מבחני נדידת תאים תלת מימדיים במבחנה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו היסטולוגית ואימונוהיסטוכימיה, כדי לענות על שאלות נוספות לגבי האופן שבו מבנה רשת הפיברין בתוך הקריש או יישור האקטין בתאים הספרואידים תואם נדידת תאים מוגברת או מופחתת.

אל תשכח שעבודה עם תרביות תאים ומחטים עלולה להיות מסוכנת ביותר וכי תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן מתאים ועבודה במכסה מנוע סטרילי בעת ביצוע הליך זה.