הכישלון של ניקוי אימות בתעשיית התרופות בשל חוסר ניקיון משטח נירוסטה
11 באוגוסט 2017
חוסר שגרה מוגדר היטב באופן עקבי לנקות משטחים קופון זוהה את התורם העיקרי ושחזורים נמוך ומשתנה בנקיון אימות. כתב יד זה מתאר את הפרוטוקול הנכון של ניקוי נירוסטה קופונים.
המטרה הכללית של עבודה זו היא להשיג שיעורי התאוששות גבוהים וניתנים לשחזור של שאריות תרופות מפני השטח של לוחות פלדת אל-חלד, וזאת באמצעות יישום שיטות העבודה המומלצות לפיתוח שיטות ניקוי אנליטיות עבור מולקולות קטנות, חלבונים טיפוליים ונוגדנים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום של אימות ניקוי בתעשיית התרופות, כגון הסיבות לכשלונו של אימות הניקוי של ציוד ייצור. היתרון המרכזי של מחקר זה הוא שהוא מציג את ההליך לניקוי נכון של פני השטח של לוחות הפלדה שבהם נעשה שימוש לצורך תיקוף של שיטות אנליטיות.
כדי להתחיל בניסוי זה, הכין תמיסות דגימה של התרופה המומסת במדלל הנבחר לאחר חישוב גבול הניקיון עבור התרופה. נקה את קופוני הנירוסטה על ידי שטיפה במים וניגוב הפני השטח פעמיים למשך 10 עד 15 שניות. לאחר מכן, חזור על שלב השטיפה והניגוב עם מתנול כדי להסיר כל משקע שנותר.
לביצוע גישת הניקיון המתקדמת באמצעות תמיסונות ניקוי במקום (clean in place), השקיעו את הקופונים במים בדרגת HPLC (high performance liquid chromatography) ובצעו סוניקציה למשך שתי דקות. השקיעו את הקופונים בתמיסת דטרגנט אלקלי בריכוז 0.1% במים בדרגת HPLC ובצעו סוניקציה למשך שתי דקות. השקיעו את הקופונים שוב במים בדרגת HPLC וחזרו על הסוניקציה למשך שתי דקות.
לאחר מכן, טבול אותם בתמיסת דטרגנט חומצית בריכוז 0.1% במים בדרגת HPLC ובצע סוניקציה למשך שתי דקות. סיים בסוניקציה של שתי דקות במים בדרגת HPLC. לאחר מכן, בעזרת סרט דבק דו-צדדי, הצמד את קופוני הפלדה אל חסרת התחתית של כוס כימיאית מפלסטיק בנפח 250 milliliter.
החזיקו את הכוס כימית במהלך הפרוצדורה כדי להקל על תהליכי הדיגום והניגוב וכדי למנוע תאונות. השתמשו בפיפט עם דחיקה חיובית (positive displacement pipette) כדי להחדיר נפח תרופה מוגדר, בריכוז ובפורמולציה רצויים, בתבנית סיבובית על פני השטח של הקופון. לאחר שפני השטח של הקופון יתייבשו, טבלו מקל ניגוב יבש במבחנה המכילה 2 mL של דילואנט.
לחץ את המטב השטיפה נגד הדופן הפנימית של הבקבוק כדי להסיר עודפי ממס. השתמש בתנועות ניגוב מצד לצד, אחידות וחופפות, כדי לנגב בחוזקה את פני השטח של הקופון עם צד אחד של המטב הרטוב, עד שכל שטח הבדיקה של 50 square centimeter ינוקה. השתמש באותו צד של המטב כדי לחזור על תהליך הניגוב.
יש להעביר את המטב השחוק פעמיים על כל אחד מארבעת קצוות הקופון. סובבו את הקופון ב-90 מעלות והשתמשו בצד השני של המטב, תוך שינוי כיוון הניגוב ב-90 מעלות. חזרו על פעולת הניקוי באמצעות צד זה של המטב באותו אופן, וודאו שכל ארבעת קצוות הקופון ננגבו פעמיים.
לאחר ניגוב השטח, השתמשו במספריים כדי לחתוך את ראש המקלון לתוך מבחנת הממס. לאחר מכן, חזרו על כל הליך הדגימה באמצעות מקלון שני, תוך סיבוב הקופון ב-90 מעלות לאותו כיוון שנבחר קודם לכן. לאחר מכן, בצעו סוניקציה למבחנה המכילה את שני ראשי המקלונים למשך חמש דקות.
לאחר מכן, ערבבו את המבחנה במכשיר vortex למשך 10 שניות. לבסוף, העבירו את התמיסה למבחנה מסוג HPLC וסמנו אותה כתמיסת עבודה. כדי לשחזר את הדגימה, הכינו את תמיסות הביקורת על ידי ערבוב של 200 microliters מכל תמיסת ה-spiking של הקופון או תמיסת הדגימה עם 1,800 microliters של מדלל.
השתמשו בתמיסות אלו לביצוע כרומטוגרפיה בהתאם לפרוטוקול הכתוב. חשבו את אחוז השחזור של תמיסת העבודה של המטב השפשוף בהתבסס על השטח היחסי תחת הפסגות (AUC) של תמיסת העבודה ותמיסת הביקורת. חזרו על תהליך זה עבור שלושה דגימות (coupons) כדי לחשב את השחזור הממוצע ואת סטיית התקן היחסית.
לפני ניקוי הקופונים, תוצאות ההשבה עבור רמות הוספה שונות היו לא עקביות, ללא קשר למרכיב הפעיל התרופתי או ליחס בין ה-API לחומרי העזר, לאנליסטים שונים, או אפילו ליום שונה עבור אותו אנליסט. למרבית תוצאות ההשבה הייתה סטיית תקן יחסית גבוהה. השונות שנצפתה בהשבה לא נעלמה כאשר הותאמו מספר פרמטרים שונים, כולל טכניקת הדגימה במטוש, המדלל, ממס ההוספה, ה-pH של החומר המוסף והמדלל, טכניקת ההוספה וטכניקת המיצוי.
ההבדל בין ההשבה האינדיבידואלית בכל משטח קופון לבין ההשבה הממוצעת מראה כי ההשבה הממוצעת שונה ממשטח קופון אחד למשנהו, ולכן, סביר מאוד שהשונות שנצפתה נובעת מההבדלים בין משטחי הקופונים. לאחר ביצוע ניקוי הקופונים המתואר בפרוטוקול זה, תוצאות ההשבה היו ניתנות לשחזור מניסוי אחד למשנהו, עם הבדל מינימלי בהשבה בין הקופונים. ניקוי הקופונים שבוצע כאן הוביל לערכי השבה הגבוהים מ-90%. יתרה מכך, ערכי סטיית התקן היחסית עבור כל רמת הוספה (spiking) היו מקובלים ונמוכים מהתוצאות שהתקבלו לפני הניקוי.
ברגע שהתהליך נלמד היטב, ניתן לבצע את ניקוי הקופונים בפחות מ-30 דקות, אם הוא מבוצע כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כיצד לבצע הוספה (spike) והשחאה (recovery) בצורה נכונה כדי לא לאבד את האנליט המבוקש. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו יש לנקות נכון משטחי פלדת אל-חלד כדי להשיג השחאות גבוהות וניתנות לשחזור של השאריות.
לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתעשיית התרופות לספק נתוני ניקוי מהימנים עבור תהליכי ייצור.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה עוסק באתגרים הכרוכים באימות ניקיון של שאריות תרופתיות מלוחיות פלדת אל-חלד. הוא מציג פרוטוקול שעבר ולידציה להשגת שיעורי התאוששות גבוהים וניתנים לשחזור של השאריות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- אימות ניקיון תרופתי
- פיתוח שיטות אנליטיות
- טכניקות לניקוי משטחים
רקע
- אימות ניקיון הוא קריטי בתעשיית התרופות.
- נהלי ניקיון לא עקביים מובילים לשיעורי התאוששות משתנים.
- דגימות פלדת אל-חלד (coupons) משמשות בדרך כלל לצורך תיקוף.
- שיטות ניקיון נאותות חיוניות לקבלת תוצאות אנליטיות מדויקות.
מטרת המחקר
- לקביעת פרוטוקול ניקוי מהימן עבור דגימות נירוסטה.
- לשיפור שיעורי ההשבה של שאריות תרופתיות.
- לטיפול בכשלים בתהליכי אימות ניקוי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תמיסות דגימה של תרופות במדלל נבחר.
- חישוב גבולות ניקיון עבור תרופות ספציפיות.
- שטיפת קופונים של פלדת אל-חלד במים.
- ניגוב המשטח עם מטלית למשך 10 עד 15 שניות.
- חזרה על השטיפה והניגוב באמצעות מתנול להסרת שאריות.
תוצאות עיקריות
- השיטה המתוארת מנקה ביעילות משטחים של פלדת אל-חלד.
- הושגו שיעורי התאוששות גבוהים וניתנים לשחזור של שאריות תרופות.
- הפרוטוקול נותן מענה לסוגיות מרכזיות באימות ניקיון.
- הבנה משופרת של תהליכי ניקיון בהקשר הפרמצבטי.
מסקנות
- יישום פרוטוקול ניקוי נכון משפר את שיעורי ההתאוששות.
- מחקר זה מספק מסגרת למחקרי אימות ניקוי עתידיים.
- שיטות ניקוי נאותות חיוניות לתיקוף של שיטות אנליטיות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
אי-עקביות באימות הניקיון, הנובעת מהשבה משתנה של שאריות ממשטחי פלדת אל-חלד, מהווה סיכון משמעותי בייצור תרופתי, ועלולה להוביל לתוצאות שגויות שליליות (false negatives) בתיקוף הניקיון ולפגיעה בבטיחות המוצר. מחקר זה מזהה ניקיון לא מספק של המשטח כמקור העיקרי לשונות, ומציג פרוטוקול סטנדרטי לניקוי במקום (CIP) המבטיח השבה גבוהה (>90%) וניתנת לשחזור עבור מולקולות קטנות וביומולקולות גדולות עד 50,000 Da. באמצעות ביסוס הליך ניקיון אמין עבור קופונים אנליטיים, השיטה תומכת בהערכה מדויקת של תהליכי ניקיון, מאפשרת קבלת החלטות מבוססת נתונים בתחום חיטוי הציוד ומפחיתה את הסיכון לזיהום כתוצאה מהעברה (carryover contamination).
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מבטיח שנתוני השבת השאריות משקפים נוכחות אמיתית של האנליט ולא שונות הנגרמת מהמשטח, ובכך תומך בפירוש מדויק של התנהגות התרכובת בסריקה ראשונית.
- ערך תפעולי: מספק שלב ניתן לשחזור להכנת קופון (coupon), הממזער שונות בין אנליסטים שונים ושונות בתוך אותו יום במדידות של השבת שאריות.
סקר ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מאפשר השבה עקבית הן של תרופות ממולקולות קטנות (<1,000 Da) והן של ביו-מולקולות גדולות (עד 50,000 Da), מה שמאפשר יישום אחיד במערכי סריקה של מודליות מגוונות.
- ערך תפעולי: מספק סטיית תקן יחסית נמוכה (Srel ≤4%) לאחר ניקוי CIP, מה שמבטיח דיוק ואמינות של הבדיקה עבור אנליזת שאריות בסריקה רב-מסית (high-throughput).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך בתרגום של ממצאים אנליטיים משלבי הגילוי לשלבים הפרה-קליניים על ידי אספקת שיטה סטנדרטית להכנת פני השטח, המפחיתה ייחוס שגוי של הבדלי התאוששות לגורמים של פורמולציה או גורמים ביולוגיים.
- ערך תפעולי: מקל על השוואה של נתוני אימות ניקיון בין מחקרים שונים באמצעות הליך ניקוי קופונים מוגדר היטב וניתן לשחזור.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow)
השיטה משולבת בתהליך הגילוי והפיתוח כשלב קדם-עיבוד קריטי עבור בדיקות אימות ניקיון, והיא ממוקמת לאחר הוספת התרכובת (spiking) ולפני השחלוף באמצעות מטוש והניתוח הכרומטוגרפי, כדי להבטיח שההשבה הנמדדת משקפת רמות שאריות אמיתיות ולא תוצרים של ניקיון שטח לא מספק.
- ביולוגיה של הגילוי (Discovery Biology): מבטלת רעשים הקשורים לפני השטח בנתוני השחזור, ובכך מאפשרת לחוקרים להתמקד בפירוש של "דביקות" אמיתית של תרכובות או השפעות של פורמולציה במהלך הפיתוח המוקדם.
- סריקה (Screening): מבטיחה את מוכנות הבדיקה באמצעות אספקת משטחים עקביים בעלי שיעור שחזור גבוה, התומכים בהערכה מהימנה של תרכובות בעלות תכונות פיזיקו-כימיות משתנות.
- אנליטיקה: מייצרת מדידות שחזור כמותיות עם שונות נמוכה (Srel ≤4%), המאפשרות השוואה מדויקת של תנאי ניקוי והשפעות פורמולציה.
- מחקר תרגומי (Translational Research): שומרת על רצף בנתוני אימות הניקוי מהפיתוח המוקדם ועד לשלבים הפרה-קליניים, על ידי סטנדרטיזציה של משתנה מפתח — ניקיון פני השטח — לאורך המחקרים.
- שימוש חוזר בארגון (Enterprise Reuse): מבססת הליך סטנדרטי וניתן לשימוש חוזר להכנת קופוני פלדה אל-חלודה שניתן לאמץ במעבדות ובפרויקטים מרובים, ובכך מפחיתה סטיות מתודולוגיות ומשפרת את שלמות הנתונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי באימות ניקיון על ידי הבחנה בין רמות שאריות אמיתיות לבין שונות הנגרמת מהמשטח, ובכך מפחית עמימות מכניסטית בהערכת תהליך הניקיון.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות של בדיקות אימות ניקיון באמצעות הליך CIP מוגדר היטב המבוסס על סוניקציה, הממזער את השונות התלויה במבצע.
- ערך אסטרטגי: תומך בקבלת החלטות טובה יותר לגבי המשך התהליך (go/no-go) בפיתוח פורמולציות ותהליכים על ידי אספקת נתוני ניקיון מהימנים, ובכך מפחית סיכוני זיהום וסיכונים ביולוגיים בשלבים מאוחרים.
- השפעה על תיק המוצרים: מאפשר תיעדוף של מועמדים לתרופות ותהליכי ייצור מותאם-סיכון, בהתבסס על תוצאות אימות ניקיון ברות-הסבר בעלות שונות נמוכה.
שיקולי יישום
- נדרשת הכשרה בטכניקת סבוב (swabbing) נכונה, תזמון סוניקציה וטיפול בתמיסות כדי להבטיח ביצוע עקבי של שלבי הניקוי וההשבה.
- תלוי בגישה למים בדרגת HPLC, אמבטיות אולטרסוניות, תמיסות דטרגנט בסיסיות וחומציות, ופיפטות דחיקה חיובית (positive displacement pipettes) לצורך הוספה מדויקת של חומר (spiking).
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של תזמוני הניקוי, ריכוזי התמיסות ותבניות הסבוב כדי לשמור על הדירות (reproducibility) בין מעבדות ומשמרות.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום הפרוטוקול על גאומטריות או חומרים שונים של קופונים, אם כי השיטה תוקפה עבור משטחי פלדת אל-חלד המשמשים בוולידציה אנליטית.
- מגבלות מעשיות כוללות את הצורך בטיפול זהיר כדי למנוע זיהום חוזר לאחר הניקוי, ואת החשיבות של ייבוש מלא של הקופונים לפני ההוספה (spiking) כדי למנוע אפקטים של דילול.
