התפתחות מודל פרה האנושית של Osteoclastogenesis של דם היקפיים ומונוציטים תרבותי משותף עם שורות תאים של סרטן השד
13 בספטמבר 2017
פרוטוקול זה מתאר את התפתחות במבחנה האנושי פרה מודל של osteoclastogenesis של דם היקפיים ומונוציטים תרבותי עם שורות תאים של סרטן השד כדי לחקות את האינטראקציה תא-אוסטאוקלסט סרטן. המודל יכול לשמש כדי לקדם את ההבנה שלנו של עצם היווצרות גרורות ולשפר את אפשרויות טיפוליות.
המטרה הכוללת של מודל פרה-קליני אנושי זה במבחנה של אוסטאוקלסטוגנזה שמקורו במונוציטים בדם היקפי, או PBMCs, שגודלו עם קווי תאי סרטן השד היא לחקות אינטראקציות אוסטאוקלסטים של תאי סרטן. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום גרורות העצם לגבי ההשפעות של אינטראקציה בין תאי סרטן ותאי עצם בתוך מיקרו-סביבת העצם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמדובר במודל פרה-קליני אנושי לחלוטין.
כמו כן, שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי גרורות בעצמות. ניתן ליישם אותו גם לחקר מנגנונים פתולוגיים אחרים הקשורים לעצם, כגון אוסטאופורוזיס. אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להיאבק בגלל השונות בין תורמים בריאים ובבחירת צפיפות תאי PBMC המתאימה.
הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שהם צריכים לראות את שלבי הבחירה והזריעה של PBMC שלנו דורשים ניסיון ידני לפני שניתן יהיה להשיג מיומנות. התחל בדילול של לפחות 20 מיליליטר של דם מלא מתורם בריא ב-EDTA ביחס של אחד לאחד ב-PBS. לאחר ערבוב יסודי, פצלו את תמיסת הדם ל-30 מיליליטר בצינורות חרוטיים של 50 מיליליטר.
הניחו בזהירות 15 מיליליטר של מדיום הפרדת לימפוציטים בתחתית כל צינור. הפרד את התאים על ידי צנטריפוגה של שיפוע צפיפות. ומשוך את התא החד-גרעיני הלבן המכיל מעילי באפי לתוך שפופרת חדשה של 15 מיליליטר.
שטפו את התאים שנקטפו פעמיים ב-20 מיליליטר PBS לכל שטיפה, ולאחר מכן ליזה של כדוריות הדם האדומות עם חמישה מיליליטר של מאגר ליזה של כדוריות דם אדומות למשך שלוש עד חמש דקות, על קרח. עצור את התגובה עם 20 מיליליטר PBS, ואסוף את תאי הדם הלבנים על ידי צנטריפוגה. השעו מחדש את הגלולה והשלימו אלפא M-E-M לספירה.
לאחר מכן, צלחו את התאים בשבע נקודות חמש כפול 10 לריכוז של חמישה PBMC לסנטימטר רבוע בכל באר של צלחת של 24 בארות לדגירתם ב-37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזי CO2. לאחר כשלוש שעות, הסר את הסופרנטנט, הפסולת, התאים הלא מחוברים והאריתרוציטים הלא ליזים מהתרבויות. ולהוסיף מדיום טרי, בתוספת MCSF.
ארבעה עשר יום לאחר הזריעה יש לשטוף את התאים פעמיים עם PBS, ולתקן אותם בארבעה אחוז פרפורמלדהיד למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. בצע צביעת מלכודת בהתאם להוראות היצרן. התאים דמויי האוסטיאוקלסט יהיו חיוביים ל-TRAP עם לפחות ארבעה גרעינים.
ספרו את התאים דמויי האוסטיאוקלסט באופן ידני מתחת למיקרוסקופ בהגדלה של פי 10. עבור התמיינות אוסטאוקלסטים המושרה על ידי תאי סרטן כאשר תאי הסרטן מגיעים למפגש של תשעים אחוז, הם מנותקים על ידי טריפסיניזציה ונזרעים על נקבוביות נקודת אפס של ארבעה מיקרומטר בריכוז של ארבעה כפול 10 לשלושה תאים לסנטימטר רבוע באלפא MEM טרי. למחרת, הניחו את התוספות הזרוע על תרביות תאים חד-גרעיניים מצופים ליום אחד באלפא M-E-M שלם, והחליפו את המדיום כל יומיים-שלושה.
לאחר מכן, 11 יום לאחר תחילת התרבות המשותפת, העבירו את התוספות לצלחת חדשה המכילה את המגיב המתאים לניתוח הרצוי במורד הזרם. תאי סרטן השד יכולים לקיים אוסטאוקלסטוגנזה, מכיוון שמספר האוסטיאוקלסטים בבארות המושרות על ידי תאים סרטניים דומה לזה המתקבל בבארות הבקרה של גורם הגדילה החיובי. עם זאת, מספר האוסטיאוקלסטים שנצפו בכל התרביות מצטמצם כאשר התאים מטופלים בתרופה אנטי-גידולית.
מעניין ששטחי הפנים של אוסטאוקלסטים בוגרים שמקורם בגורמי גדילה גדולים מאלה המושרים על ידי תאים סרטניים. השפעה זו אינה נצפית בתרביות שטופלו בתרופות נגד גידולים. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך שבע ושמונה שעות אם היא מבוצעת כראוי.
לאחר הליך זה, ניתן לבצע ניתוח נוסף במורד הזרם כניתוח ביטוי גנים, כתם מערבי, ניתוח אימונופלואורסצנטי או ELISA כדי לענות על שאלות נוספות לגבי אינטראקציות בין תאים סרטניים/תאי עצם או לגבי מנגנוני תרופות נגד גידולים. לאחר פיתוחה טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום גרורות העצם לחקור את המיקרו-סביבה של העצם, במודל פרה-קליני אנושי מלא. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לתרבית מונוציטים במשותף, לעבור התמיינות עם תאים סרטניים.
אל תשכח שעבודה עם דגימות ביולוגיות ותרופות עלולה להיות מסוכנת ביותר וכי תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות ומעילי מעבדה בעת ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר פיתוח של מודל פרה-קליני אנושי in vitro של אוסטאוקלסטוגנזה (osteoclastogenesis) ממונוציטים של דם פריפרי, המוצאים בתרבית עם שורות תאי סרטן השד כדי לדמות את האינטראקציה בין תאי הסרטן לאוסטאוקלסטים. מודל זה עשוי לסייע במתן תשובות לשאלות מרכזיות בנוגע למטסטזות בעצם ולשיפור האפשרויות הטיפוליות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אוסטאוקלסטוגנזה
- גרורות בעצם
- אינטראקציות בין תאי סרטן
רקע
- המודל עושה שימוש במונוציטים מדם פריפרי (PBMCs).
- מטרתו היא לשחזר את האינטראקציות בין תאי סרטן לבין אוסטאוקלסטים.
- מחקר זה הוא משמעותי להבנת פתולוגיות הקשורות לעצם.
- שונות בין תורמים בריאים עשויה להשפיע על התוצאות.
מטרת המחקר
- לחקות אינטראקציות בין תאי סרטן לאוסטאוקלסטים.
- לחקור את ההשפעות של אינטראקציות אלו בתוך מיקרו-סביבת העצם.
- לספק תובנות לגבי גרורות בעצם ומצבים קשורים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תרבית של PBMCs עם שורות תאים של סרטן השד.
- הערכה של תהליך האוסטאוקלסטוגנזה (osteoclastogenesis).
- הערכה של האינטראקציות בין תאי סרטן לתאי עצם.
- ניתוח של השונות בצפיפות תאי PBMC.
תוצאות עיקריות
- המודל מחקה בהצלחה אינטראקציות בין תאי סרטן לאוסטאוקלסטים.
- התובנות שנרכשו יכולות להוות בסיס לאסטרטגיות טיפוליות עבור גרורות בעצם.
- יישומים פוטנציאליים מתרחבים למחלות אחרות הקשורות לעצם.
- אתגרים כוללים שונות בין תורמים ובחירת צפיפות התאים.
מסקנות
- מודל פרה-קליני זה בבני אדם בעל ערך למחקר של גרורות בעצם.
- הוא משפר את ההבנה של אינטראקציות בין תאי סרטן בסביבה המיקרובית של העצם.
- מחקרים עתידיים יכולים לנצל מודל זה עבור יישומים רחבים יותר בפתולוגיה של העצם.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודל פרה-קליני אנושי מלא זה מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית של מסלולים אוסטאוקלסטוגניים במטסטזות בעצם, על ידי שחזור של השילוב (crosstalk) בין תאי סרטן לאוסטאוקלסטים במערכת רלוונטית פיזיולוגית. הוא תומך בתיקוף מטרות ובפיתוח בדיקות עבור תרופות אנטי-גידוליות על ידי אספקת תוצאים כמותיים של בידול ותפקוד אוסטאוקלסטים. המודל מגביר את הביטחון החזוי בזיהוי מועמדים מובילים (leads) על ידי מתן אפשרות לתצפית ישירה על אינטראקציות הדדיות וניתוח המשך של שני סוגי התאים תחת תנאי טיפול תרופתי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות בנוגע לאוסטאוקלסטוגנזה המושראת על ידי גידולים ובירור מסלולים בסביבה המיקרוסקופית של העצם.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים ובתיקוף תפקודי של מטרות באמצעות מידול התמיינות אוסטאוקלסטים ממונוציטים ראשוניים של בני אדם תחת תנאי תרבית משותפת מוגדרים.
- ערך מדעי: מסייע בביסוס ביטחון חיזוי ובמיון תיקי פיתוח על ידי כימות היווצרות אוסטאוקלסטים בתגובה לגירויים של תאי סרטן לעומת ביקורות של גורמי גדילה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנת מערכות ביולוגיות מתוקפות לתהליכי עבודה המשכיים באמצעות דיפרנציאציה סטנדרטית של אוסטאוקלסטים מ-PBMCs תוך שימוש ב-RANKL וב-MCSF.
- ערך תפעולי: מענה לסטנדרטיזציה של הבדיקה וליכולת השחזור שלה באמצעות זריעה בצפיפות תאים קבועה (7.5×10⁵ PBMC/cm²) ודיפרנציאציה מתוזמנת (14 ימים) עם כימות אוסטאוקלסטים מבוסס TRAP.
- ערך מדעי: מאפשר הערכה אמינה של תרכובות על ידי בדיקת השפעות תרופתיות על אוסטאוקלסטוגנזה בפורמטים של תרבית משותפת עקיפה (מדיום מותנה) וישירה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך במידול רלוונטי למחלות עבור אוסטאופורוזיס ומצבי עצם אחרים באמצעות התאמה של בדיקת an osteoclastogenesis.
- ערך תפעולי: מבטיח רציפות תרגומית על ידי שימוש בתאים אנושיים מלאים, ובכך מפחית את הסיכון בתרגום בין מינים במעבר של מודלים פרה-קליניים לשלב הקליני.
- ערך מדעי: מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאם סיכונים על ידי מדידת שינויים במספר האוסטאוקלסטים ובשטח הפנים שלהם כסמנים פרמקודינמיים ליעילות התרופה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
המודל משתלב ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה, דרך זיהוי מובילים (lead identification), ועד לבדיקות יעילות פרה-קליניות, במיוחד עבור טיפולים המכוונים לעצם ומודולטורים של מיקרו-סביבת העצם.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות לגבי גורמים המופקים מתאי סרטן בהפעלה של אוסטאוקלסטים ובבירור נתיבים של מנגנוני השראה של אוסטאוקלסטים ללא תלות ב-RANKL.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות בידוד סטנדרטי של מונוציטים, דיפרנציאציה וקו-קלטורה עם שורות תאי סרטן השד על תבניות חדירות (permeable inserts) למחקרים של סיגנלינג פראקריני ויוקסטקריני.
- אנליזה: מספקת מדדים כמותיים של אוסטאוקלסטים באמצעות צביעת TRAP, ספירת תאים רב-גרעיניים ואנליזה מורפומטרית (שטח פנים) להשוואת תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מקשר לרצף פרה-קליני על ידי מתן אפשרות למחקר של השפעות תרופות על המיקרו-סביבה הגרמית מטאסטטית באמצעות שורות תאי סרטן שד רלוונטיות קלינית.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כפלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר למחקר של מודולציה של אוסטאוקלסטים במגוון סוגי סרטן ופתולוגיות גרמיות מעבר לסרטן השד.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזואי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת עמימות מכניסטית באינטראקציות בין תאי אוסטאוקלסט לתאי סרטן.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ויכולת שחזור באמצעות פרוטוקולים מוגדרים לבידוד PBMC, צפיפות זריעה והשלמת ציטוקינים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי אפשור הערכה מוקדמת של השפעות תרופות על היווצרות ותפקוד של אוסטאוקלסטים, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלב מאוחר בתוכניות של גרורות בעצם.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים על ידי כימות הפוטנציאל האוסטאוקלסטוגני של תרכובות והכוונת ההתקדמות בהתבסס על מודולציה של המיקרו-סביבה של העצם.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות של בידוד, תרבית וגילוי (דיפרנציאציה) של תאי אדם ראשוניים, כולל הפרדת PBMC והצמדה של מונוציטים.
- תלוי בציוד לספירת תאים, צנטריפוגה, מיקרוסקופיה (הגדלה של 10X לספירת אוסטאוקלסטים) ודגירה (37°C, 5% CO₂).
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של מקור תורמי ה-PBMC, אופטימיזציה של צפיפות התאים (7.5×10⁵ PBMC/cm²) ותזמון התרבית המשולבת (11 ימים לאחר זריעת תאי הסרטן) כדי לצמצם שונות.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבת הפרוטוקול לקווי תאים של סוגי סרטן שאינם של השד, או לגירויים חלופיים לאוסטאוקלסטים מעבר ל-RANKL/MCSF.
- כולל מגבלות מעשיות כגון שונות בין תורמים בפוטנציאל הדיפרנציאציה לאוסטאוקלסטים והצורך במיומנות ידנית בזריעת PBMC ובהקמת התרבית המשולבת.
