שבב מבוסס תלת ממדי נייד תרבות Micro-bioreactors perfused

שלום, אני אריק גוטוולד ואני מדען מחקר במכון לממשקים ביולוגיים של מכון הטכנולוגיה וור (Ware Institute of Technology). והיום אני מעוניין להציג בפניכם את המערכת המיקרו-ביו-אקטיבית מבוססת השבב עם זרימה רציפה שלנו. לפני שנוכל להשתמש בשבב ביישומים של תרביות תאים, עלינו לבצע הידרוליזה לפולימר ולבצע דגראציה לאזור בעל המבנה המיקרוסקופי.

דבר זה מושג על ידי טבילה של השבב בריכוזים שונים של איזופרופנול, החל מ-100%. אני טובל את השבב למשך מספר שניות בודדות בכל ריכוז, והשלב הסופי הוא מים בלבד. לאחר מכן, השבב מיובש ולבסוף עלינו לצפות את השבב בתמיסת collagen one כדי להקל על היצמדות התאים לפולימר. פעולה זו מבוצעת על ידי טפטוף של מספר טיפות בודדות של תמיסת collagen one על גבי האזור בעל המבנה המיקרוסקופי, ובמצב זה, השבב מדוגר בטמפרטורה של 4 °C למשך לילה.

לאחר דגירה למשך לילה עם תמיסת הקולגן one, מסירים את התמיסה ושוטפים את השבב עם PBS סטרילי. לאחר מכן, מסירים גם את ה-PBS והשבב מוכן כעת להחדרת התאים. כעת נחדיר לשבב התאים סספנזיה של תאים בודדים, וזאת על ידי הנחת 150 µL של סספנזיית תאים מעל האזור בעל המבנה המיקרוסקופי. לאחר השקיעת התאים, מדגרי את השבב למשך שלוש שעות בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור.

לאחר תקופת דגירה של שלוש שעות, מוציאים את השבב מהמדגרה והוא מוכן כעת להכנסה לתוך ה-ector. לשם כך, מוציאים את ה-ector מאריזתו הסטרילית, כאשר הסטריליות הושגה באמצעות הקרנת גמא של רדיד השקיפות. לכן, עלינו רק לפתוח את האריזה ולהוציא את ה-ector.

בשלב הבא, נכניס את חלקו העליון של הבקבוק אל מאגר המדיום, כדי שנוכל לפרק את מעטפת הביוראקטור לצורך הכנסת השבב. לאחר פתיחת מעטפת הביוראקטור, ניתן כעת להכניס את השבב, זאת על ידי הנחתו בתוך החריץ של מעטפת הביוראקטור, ולאחר מכן ניתן להרכיב את הביוראקטור מחדש. לסיום, עלינו לחבר שני מסננים סטריליים למאגר המדיום ופתח דגימה סטרילי אחד.

למדידת מתח החמצן בפועל בלולאת הסירקולציה הסגורה, נכניס שני חיישני חמצן על ידי התקנתם בין שני המחברים הללו. הבקטור מוכן כעת למילוי במצע תרבית. מערכת הבקטור מוכנה כעת למילוי במצע תרבית תאים, ודבר זה מושג פשוט על ידי חיבור לולאת הסירקולציה הסגורה למשאבת הגלילים.

בדרך זו, נוריד בו-זמנית את קצב כל סירקולציית הביאקטור (bactor). כפי שניתן לראות כאן בחלון ה-Ector, ניתן לראות את המדיום עולה מלמטה, עולה ועולה, ועוזב את הביאקטור בחלקו העליון. לפני שנניח את מערכת הביאקטור בתוך האינקובטור, נבצע בקרה למילוי נטול בועות של לולאת הסירקולציה.

כעת המערכת מלאה לחלוטין במצע לתרבית תאים וניתן להעביר את הביוראקטור לאנקובטור. כעת נניח את הביוראקטור לתא הדגירה. לשם כך, ראשית, הביוראקטור מחובר למשאבה הגלילית, כפי שראיתם לפני זמן קצר, וכעת הביוראקטור עובר פרפוזיה פעילה של המצע מהבקבוק.

וכדי לשמור על ריכוז החמצן בסביבה, נחבר את מאגר המצע לאספקת הגז. ולסיום, נחבר שני חיישני חמצן למערכת הסירקולציה כדי לנטר באופן מקוון (online) את מתח החמצן במערכת. כעת ההתקנה הושלמה והיא יכולה לפעול למשך הזמן שתוכנן עבור הניסוי.

אחד הכלים העוצמתיים ביותר במהלך ניתוח הפונקציות האורגנוטיפיות של התאים בתוך מכלי ה-MicroCon הוא מיקרוסקופ הסריקה הלייזרי, שניתן לראות כאן. מיקרוסקופ הסריקה הלייזרי מעניק לנו את ההזדמנות לבחון כל מכל MicroCon בודד ללא הרס. ומכיוון שניתן להשתמש במכלי ה-MicroCon או בצ'יפ לשיטות צביעה אימונולוגית קונבנציונליות ושיטות אימונופלואורסצנציה, אנו יכולים לזהות סוגים שונים של מרקרים ופונקציות אורגנוטיפיות בתוך המיקרו-מכלים.

כפי שניתן לראות כאן, באנימציה של שבב זה, התחתית מלאה לחלוטין בתאים, כמו גם דפנות מיכל ה-MicroCon. יש לנו שפע של תאים החיים למדי, ומספר מועט מאוד של תאים מתים. התמונה הבאה מראה שניתן לזהות את כל סוגי התפקודים האורגנוטיפיים בתוך מיכל ה-MicroCon.

לדוגמה, עבור הפטוציטים, ניתן לראות כאן בצורה ברורה בחפיפה את ייצור האלבומין או את הביטוי של E-cadherin בתאים. הגרעין צבוע בכחול, ה-E-cadherin צבוע בירוק, והאלבומין מבוטא או צבוע באדום.

וכפי שניתן לראות כאן בבירור, כל הפונקציות האורגנוטיפיות המצופות מהפטוציטים באות לידי ביטוי בצורה טובה בסוג זה של תרבית תלת-ממדית (3D). בנוסף, בחנו מרקר הפטוציטים נוסף, והוא cytokeratin 18, ותמונה זו מראה שגם Cytokeratin 18 מובע היטב בסוגי תרביות אלו. אני מקווה שזה משכנע אתכם שפונקציות אורגנוטיפיות מסוג זה עשויות להיות מועילות גם עבור תרביות אורגנוטיפיות אחרות.

לאחר סיום ניסוי ה-Biore, ניתן להשתמש בשבב לבידוד של סוגים שונים של רכיבים תאיים, כגון total RNA. כפי שניתן לראות כאן, אנו מציגים את ה-total RNA שהבודד ממערכת הביוריאקטור. ניתן להשתמש ב-total RNA זה ליישומים המשכיים, כגון realtime PCR, או כפי שניתן לראות כאן, ניתוח microarray.

יתרה מכך, ניתן לבודד תאים שלמים מהמערכת ולהשתמש בתאים אלו להמשך אנליזה בשיטת flow cytometry קונבנציונלית. כפי שניתן לראות כאן, אני מקווה שהצלחנו להראות שהמערכת עשויה להועיל למגוון רחב של יישומים הדורשים תגובות אורגנוטיפיות, וכן שהמערכת עשויה להועיל לכל אותם סוגי יישומים שטרם שקלנו עד כה, כגון יישומים בתחום תאי הגזע.