פרוטוקול לצורך מעקב בזמן אמת 3D חלקיק יחיד
3 בינואר 2018
פרוטוקול זה פרטים הקמה ותפעול של מיקרוסקופ מעקב בזמן אמת 3D חלקיק יחיד מסוגל מעקב הננומטרי פלורסנט רגשים במהירויות גבוהות המפזרת, המחירים ספירה נמוכה פוטון.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא ליישם מיקרוסקופ מעקב אחר חלקיקים בודדים בזמן אמת. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לנטר אובייקט יחיד בקנה מידה ננומטרי ברציפות ברזולוציה זמנית מוגבלת של פוטון. טכניקה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הווירולוגיה, כגון מעקב אחר נגיף בודד לאורך כל תהליך ההדבקה.
הכן את המכשיר על שולחן אופטי. הגדרה זו מוכנה לכיול. רכיבי המפתח כוללים לייזר מצב מוצק של 488 ננומטר, שני מסיטים אלקטרו-אופטיים הנמצאים לאורך נתיב האלומה, עדשת שיפוע אקוסטית מתכווננת ושלב דגימה עם ממקמי מיקרו וננו.
סכימה זו של ההגדרה מספקת פרטים נוספים. להלן נתיב קרן הלייזר לשלב הדגימה. המסיטים האלקטרו-אופטיים והעדשה האקוסטית המתכווננת נמצאים לאורך נתיב האלומה.
מכשירים אלה מניעים באופן דינמי את נקודת הלייזר בשלב הדגימה. פוטונים מהדגימה נספרים על ידי דיודת צילום מפולת. מצלמה עוקבת אחר מיקום החלקיק.
מיקום הדגימה נקבע באמצעות בקרי מיקרו וננו. מערך שערים הניתן לתכנות בשטח שולט בנקודת הלייזר, חישוב מיקום החלקיקים בזמן אמת, משוב שלב וספירת פוטונים. יש להכין שתי דוגמאות.
הראשון, דורש חרוזים פלואורסצנטיים של 190 ננומטר מדוללים בתמיסת מלח חוצצת פוספט. השתמש בתלוש כיסוי כדי להכין דגימת חלקיקים קבועה. הניחו 400 מיקרוליטר מתמיסת החרוזים על החלקת הכיסוי.
כעת, צור את דגימת החלקיקים הנעים בחופשיות. זה דורש חרוזים פלואורסצנטיים של 110 ננומטר מדוללים במים. צור דגימת חלקיקים נעה חופשית על ידי הנחת 400 מיקרוליטר של התמיסה על פתק כיסוי.
קח את דגימת החלקיקים הקבועה למיקרוסקופ להרכבה. הדגימה נמצאת על מיקום ננו XY. הפעל את הלייזר, את גלאי הצילום, את הבקרים עבור רכיבי קו האלומה ועבור הממצבים.
הפעל את מיקום הננו של Piezo בלולאה סגורה. לאחר מכן, הסר את מסנן פליטת הקרינה מחזית גלאי הצילום. לאחר מכן, שנה את מיקום ה-z של הדגימה עם מיקום המיקרו
.ככל שהמיקום משתנה, השתמש בגלאי הצילום כדי לנטר את עוצמת השתקפות הלייזר. מקסם את העוצמה כדי לזהות את מישור המוקד של עדשת האובייקט. כשהדגימה במישור המוקד, החלף את מסנן פליטת הקרינה.
כעת, עבוד עם תוכנת בקרת המחשב. השתמש בתוכנה מותאמת אישית כדי לסרוק רסטר את הדגימה. ראשית, הגדר טווח סריקה גדול, ההבדל בין התחלה לסיום.
כאן, הטווח הוא 10 מיקרומטר ב-Y ו-10 מיקרומטר ב-X.כמו כן, הגדר גודל מדרגה גדול לכל כיוון. כאן, 200 ננומטר. הגדר את שני שדות Z למיקום שזוהה קודם לכן של מישור המוקד.
לחיצה על סריקת רסטר תפעיל את סריקת הרסטר. התחל את הסריקה. התוכנה מניעה את המסיטים האלקטרו-אופטיים בסיור לילי, אוספת ספירות מגלאי הצילום, מניעה את מיקום הננו ומבצעת חישובי מיקום.
הסריקה תמצא חלקיק הניתן לזיהוי בתוכנה באמצעות פלואורסצנטי פלטה. עבור כל אתר בסריקה, התוכנה תקבע גם הערכות של מיקום החלקיקים ב-X ו-Y, ביחס למרכז סריקת מסיט האובייקט החשמלי. לאחר מציאת החלקיק, כווץ את טווח הסריקה סביבו לשני מיקרומטר ב-X ו-Y.כמו כן, הקטן את גודל הצעד עבור שניהם ל-100 ננומטר.
הוסף טווח סריקה בכיוון Z של שני מיקרומטר כדי לסוגריים את המיקוד הפלואורסצנטי. הגדר את גודל שלב Z ל-200 ננומטר. התחל את סריקת הרסטר התלת-ממדית כדי למצוא את המוקד הפלואורסצנטי.
הנתונים המופקים מהסריקה מראים את מישור המוקד לפני הפעלת עדשת השיפוע האקוסטית המתכווננת. עבור לעבודה עם הגדרת העדשה האקוסטית הניתנת לכוונון בתוכנת הבקרה שלה. ראשית, לחץ על התחבר, ולאחר מכן הפעל.
עבור לקטע בקרת הדופק והשער, שנה את מצב הדק הפלט מ-RGB לרב מישורים. לאחר מכן, שנה אותו בחזרה ל-RGB כדי לאפשר שינוי שלב הפלט. השתמשו במחוונים לקביעת שלב הפלט בין אפס מעלות, 90 מעלות ו- 270 מעלות.
לאחר מכן, עבור לסעיף בקרת התדרים. שם, בחר תדר תהודה של 68, 500 הרץ. עבור לראש המסך ולחץ על מתקדם.
לאחר מכן, בחר בכרטיסייה הגדרות. במסך החדש, מצא את התדירות המקסימלית של עמודת האפס. התאם אותו כדי לשנות את טווח חיפוש התדירות.
לחץ, שמור כיול ולאחר מכן צא מהכיול. חזור לבקרות התדרים ושנה את תדר התהודה. שנה אותו מיד בחזרה ל-68, 500 הרץ כדי שהכיול ייכנס לתוקף.
בקטע בקרת המשרעת, השתמש במחוון כדי להעלות לאט את המשרעת ל -35%לאחר מכן, לחץ על תהודת נעילה. כאשר התדר נעול, לחץ על בטל נעילת תהודה. חזור לתוכנת סריקת הרסטר.
הזן שני טווחי סריקה של מיקרומטר הממוקדים בחלקיק ב-X ו-Y. השתמש בגודל צעד של 100 ננומטר. מרכז את החלקיק בטווח של ארבעה מיקרומטר ב-Z, עם גודל צעד של 200 ננומטר. בתמונת הסריקה המתקבלת אזור התאורה המייצג את החלקיק הוא ברוחב של מיקרומטר אחד.
על סמך זה, התאם את פרמטר סולם XY כך שהמיקומים המשוערים ב-X ו-Y ינועו בין 0.5 ל-0.5 מיקרומטר שלילי. לאחר הליך דומה בסולם Z הגדר את מיקום הננו למצב אפס. כבה את החשמל למיקום הננו לפני שתמשיך.
החלף את דגימת החלקיקים הקבועה בדגימת החלקיקים הנעה בחופשיות. לאחר מכן, ודא שכל הציוד פועל. הפעל את מיקום הננו של Piezo בלולאה פתוחה.
במחשב, הגדר את תוכנת עדשת השיפוע האקוסטית הניתנת לכוונון כמו קודם. הסר את מסנן פליטת הקרינה מהנתיב לגלאי הצילום. מצא את מישור המוקד על ידי שינוי מיקום Z של הדגימה ומקסום עוצמת השתקפות הלייזר, מהחלקת הכיסוי.
לאחר מציאת מישור המוקד, הגדל את מיקום המיקוד ב-15 מיקרומטר לתוך התמיסה. החלף את מסנן פליטת הקרינה. פתח את תוכנת המעקב המותאמת אישית.
מגדירים את הפרמטרים של הערכת המיקום לערכים שנמצאו במהלך האופטימיזציה. כעת, הגדר את קבועי הבקרה האינטגרליים, המכתיבים את מהירות התגובה של ממקם הננו. נתחיל עם קבוע X.
הזן ערך נמוך והגדל אותו לאט. כאשר מתחילות תנודות בקריאת מיקום החלקיקים, שים לב לערך של קבוע הבקרה. צמצם את קבוע הבקרה האינטגרלי לכ- 70% מערכו בתחילת התנודה.
חזור על השלבים עם קבועי הבקרה Y ו- Z. הגדר את ההדק כדי להתחיל לעקוב אחר סף המסלול לשלושה קילו-הרץ. הגדר את מינימום המסלול, ההדק לסיום המעקב, על 1.5 קילו-הרץ.
התחל את הניסוי על-ידי לחיצה על חיפוש ולאחר מכן לחיצה על מעקב אוטומטי. סרטון זה מציג את התוצאה של שימוש במיקרוסקופ מעקב תלת מימדי ודינמי של לוקליזציה של פוטונים כדי לעקוב אחר התנועה הדיפוזיבית של ננו חלקיק פלואורסצנטי של 110 ננומטר במים. מיקום החלקיק, הנמדד באמצעות קריאת המיקום של מיקום הננו, מוצג על צירי התלת מימד.
הכניסה היא הקריאה של מצלמת אזוב הים המדעית. זה מדגים שהחלקיק מוחזק, נעול בנפח המוקד, על ידי מערכת המעקב. החלקיק היה במעקב ומיקומו נרשם במשך יותר משתי דקות.
לאחר השליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך פחות מ-50 דקות, אם המערכת מיושרת כראוי, ופרמטרי הכיול מוגדרים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו תסייע לחוקרים בתחום העברת התרופות לחקור את מסלולי ההפנמה וההובלה של מטען תאי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להפעיל מיקרוסקופ מעקב אחר חלקיקים בודדים תלת-ממדיים בזמן אפס.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט את היישום של מיקרוסקופ למעקב אחר חלקיק בודד בתלת-ממד ובזמן אמת, שתוכנן לניטור של גששים פלואורסצנטיים בקנה מידה ננומטרי. טכניקה זו מאפשרת תצפית רציפה על עצמים בודדים המפעפעים, גם בתנאים של הגבלה פוטונית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרוסקופיה
- מעקב אחר חלקיק בודד
- וירוסים
רקע
- מעקב בזמן אמת אחר חלקיקים בננו-קנה מידה הוא קריטי בתחומים מדעיים שונים.
- הבנת הדינמיקה של ויריונים בודדים יכולה לספק תובנות לגבי תהליכי זיהום.
- טכניקה זו משפרת את היכולת לחקור חלקיקים במהירויות דיפוזיה גבוהות.
- מגבלות ספירת הפוטונים מטופלות באמצעות מערכים אופטיים מתקדמים.
מטרת המחקר
- פיתוח מיקרוסקופ המסוגל לעקוב אחר חלקיקים בודדים בזמן אמת.
- הקלה על חקר זיהומים נגיפיים באמצעות ניטור של ויריונים בודדים.
- שיפור הרזולוציה הטמפורלית של מעקב אחר אובייקטים בננו-קנה מידה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בנייה של מיקרוסקופ למעקב תלת-ממדי אחרי חלקיק בודד.
- שימוש בלייזר מצב מוצק של 488 nanometer.
- שילוב של מסיטים אלקטרו-אופטיים ועדשת מדרג אקוסטי ניתנת לכיוון.
- כיול של המכשיר על שולחן אופטי עם מיקום מדויק.
תוצאות עיקריות
- המיקרוסקופ עוקב בהצלחה אחר גששים פלואורסצנטיים בננו-קנה מידה.
- הוכשרה יכולת לניטור חלקיקים בקצבי ספירה נמוכים של פוטונים.
- אפשר תצפית רציפה על ויריונים בודדים במהלך זיהום.
- סיפק תובנות לגבי הדינמיקה של תהליכים ויראליים.
מסקנות
- פרוטוקול זה מבסס שיטה חסונה למעקב אחר חלקיקים בזמן אמת.
- הוא פותח אפיקים חדשים למחקר בווירוסים ובתחומים קשורים.
- הטכניקה יכולה לשפר משמעותית את הבנתנו לגבי התנהגות נגיפית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מעקב בזמן אמת אחרי חלקיק בודד ב-3D מאפשר ניטור רציף של עצמים בננו-קנה מידה בתנאים של הגבלה פוטונית, ובכך נותן מענה לפער קריטי בתצפית על תהליכים תאיים מהירים בתלת-ממד. יכולת זו תומכת בהפחתת סיכונים מנגנוניים בשלבי גילוי מוקדמים על ידי אספקת נתונים דינמיים ברזולוציה גבוהה על אינטראקציות מולקולריות ומסלולי תעבורה. השיטה מגבירה את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות ובזיהוי מובילים (leads) באמצעות אספקת נתונים מרחביים-זמניים כמותיים הניתנים לשחזור, שהם חיוניים לקבלת החלטות מושכלות של go/no-go במחקרי הולכת תרופות ו-virology.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות מעקב אחר ויריונים בודדים או ננו-חלקיקים במהלך תהליכי הדבקה ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה.
- ערך תפעולי: מספק תיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות תצפית ישירה על דינמיקה מולקולרית בסביבות קרובות למצב הטבעי.
- ערך ניבוי: תומך במיון ותעדוף של פורטפוליו על ידי יצירת נתונים כמותיים על דיפוזיה של חלקיקים, קישור וקינטיקה של הובלה בתנאים רלוונטיים פיזיולוגית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק מדידות כמותיות של משתנים תלויים (מיקום, מסלול, מקדם דיפוזיה) החיוניות לסטנדרטיזציה של הבדיקה ולאישור פגיעות (hit confirmation).
- ערך תפעולי: מאפשר הכנה של מערכות ביולוגיות מתוקפות לסריקות המשך באמצעות לוקליזציה תלת-ממדית מדויקת ומעקב אחר גששים פלואורסצנטיים.
- יכולת הרחבה: תומך בשימוש חוזר בפלטפורמה באמצעות תכנון עמיד של עירור יחיד/גילוי יחיד ובקרה מכויילת של עדשות גרדיאנט אלקטרו-אופטיות ואקוסטיות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מגשרת בין שלב הגילוי לעבודות פרה-קליניות על ידי מתן אפשרות לצפייה בזמן אמת של פילנייה (internalization) של מטען תאי ומסלולי הובלה הרלוונטיים להעברת תרופות.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מפחיתה עמימות במודלים של כניסה ויראלית ותעבורה תוך-תאית באמצעות ויזואליזציה ישירה של התנהגות חלקיק בודד בתמיסה.
- קידום מותאם סיכונים: מספקת בסיס לקבלת החלטות של המשך או עצירה (go/no-go) על ידי אספקת נתונים הניתנים לשחזור ובנאמנות גבוהה על התנהגות ננו-חלקיקים בתנאים של שטף פוטונים נמוך.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות, דרך זיהוי מועמדים (leads) ועד לתיקוף פרה-קליני, במיוחד עבור מחקרים הדורשים רזולוציה דינמית בננו-קנה מידה בשלושה ממדים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי מתן אפשרות למעקב רציף אחר חלקיקים בודדים במרחב תלת-ממדי תחת תנאים המדמים תנאים פיזיולוגיים.
- סריקה: משפרת את מוכנות הבדיקה באמצעות לוקליזציה ומעקב הדירים של חלקיקים, מה שמאפשר הערכה מהימנה של תרכובות או ננו-חלקיקים.
- אנליטיקה: מייצרת פלטים כמותיים (מיקום, מהירות, הגבלה) המאפשרים השוואה אובייקטיבית של תנאי ניסוי ומועמדים טיפוליים.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית על ידי מידול מסלולי הולכת תרופות ודינמיקה של זיהומים נגיפיים במערכות רלוונטיות ביולוגית.
- שימוש חוזר ארגוני: מתפקד כבסיס פלטפורמה לשימוש חוזר הודות למבנה האופטי המודולרי, לפרוטוקול הכיול וליכולת ההסתגלות לסוגי דגימות ומטרות מעקב שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף מטרות על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בתהליכים ביולוגיים בקנה מידה ננומטרי.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ושחזור באמצעות סריקת רסטר (raster scanning) מכוילת, אלגוריתמים להערכת מיקום ומיקום ננומטרי מבוקר-משוב.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון ומפחית סיכונים ביולוגיים בשלבים מאוחרים על ידי מתן אפשרות לקבלת החלטות מוקדמות מבוססות נתונים לגבי יכולת הטיפול התרופתי (druggability) במטרה והיתכנות של מנגנון ההובלה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם-סיכון באמצעות נתוני מעקב כמותיים ברזולוציה גבוהה, המהווים בסיס לקריטריונים של קידום בפיתוח תרופות אנטי-ויראליות ומנגנוני הובלת תרופות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות ביישור אופטי, בטיחות בלייזר ומערכות בקרה בזמן אמת, כולל לולאות משוב מבוססות FPGA.
- תלוי במכשור ייעודי: לייזר מצב מוצק 488 nm, מסיטים אלקטרו-אופטיים דו-ממדיים, עדשת גרדיאנט אקוסטית ניתנת לכוונון, פוטודיודה מסוג avalanche ובמי במעמדי ננו-מיקום.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית עבור פרוטוקולי כיול, פרמטרים של אומדן מיקום וכוונון קבועי בקרה אינטגרלית בין משתמשים ומעבדות.
- כולל שיקולי התאמה בעת מעבר מדגימות של חרוצים קבועים לחלקיקים נעים בחופשיות בתווך ביולוגי צמיגי או מורכב.
- מגבלות מעשיות כוללות רגישות לקצבי ספירת פוטונים והצורך באופטימיזציה קפדנית של ספי סגיית המעקב (למשל, התחלה ב-3 kHz, סיום ב-1.5 kHz) כדי לשמור על נעילה בתנאים של אות חלש.
