ופשוט נמוכים Assay למדידת Ambulation במודלים של העכבר של ניוון
29 בדצמבר 2017
פרוטוקול זה מתאר מערכת גמישה, בעלות נמוכה למדידת העכבר ambulation ב assay פעילות שדה פתוח. אנו מראים כי וזמינותו 6 דקות ambulation מבוסס על מערכת זו מזהה ירידה בהיקף התנועה הרצונית בעכברים mdx , במדויק מבדיל שיפור חילוץ שרירים ספציפיים של חיות אלו.
המטרה הכללית של בדיקה זו היא למדוד הליכה רצונית במודלים של עכברים עם דיסטרופיה שרירית. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הדיסטרופיה השרירית בנוגע להתקדמות החולשה השרירית במודלים של עכברים עם דיסטרופיה שרירית, ולהשפעתן של תרופות פוטנציאליות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת מדידה לא פולשנית וניתנת לשחזור של פעילות בעלי חיים, שניתן להתאימה בקלות למסגרות מחקר שונות רבות.
בחדר שקט בטמפרטורה מבוקרת ובשעה עקבית של היום, הניחו מצלמה על רשת תיל מעל תא הפעילות כדי לאפשר הקלטה של כל שטח הזירה, ונקו את התא באמצעות חומר חיטוי. מיד לפני הקלטת הפעילות, אפשרו לעכבר לאחוז במוט של מד כוח דיגיטלי ומשכו בעדינות לאחור עד לשחרור המוט. רשמו את שיא המתיחות ב-Newtons עבור כל ניסוי.
עם דקה אחת של מנוחה בין הניסויים. מיד לאחר בדיקת כוח האחיזה, מקמו את העכבר בתא והתחילו בהקלטת הווידאו, ואפשרו לעכבר לחקור את הסביבה בחופשיות. לאחר שש דקות הפסיקו את ההקלטה, והחזירו את העכבר לכלוב המגורים שלו.
עבור ניתוח מעקב של נתוני הווידאו, פתח תחילה את ההקלטה בתוכנת עריכת הווידאו המתאימה, והגדר את המהירות לפי פי שניים. ייצא את הווידאו המופחת בפורמט קובץ mp4 לצורך ניתוח המעקב, ופתח את הווידאו בתוכנת ניתוח הווידאו המתאימה. כדי להגדיר את הכיול עבור הקלטת הווידאו, השתמש בכלי הקו כדי לשרטט קו לאורך צדו של התא.
לחצו קליק ימני על הקו, בחרו בכיול מדידה (calibrate measure), והזינו את הגודל הממשי של דופן התא בסנטימטרים. כדי להתחיל מעקב חצי-אוטומטי אחר מיקום העכבר, לחצו על סמן ההזזה (move cursor). החל מהפריים הראשוני בווידאו, לחצו קליק ימני על הנקודה שברצונכם לעקוב אחריה.
נקודת המעקב תסומן בעיגול כחול. השתמשו במקש החץ ימינה במקלדת כדי להתקדם לפריים הבא. נקודת המעקב אמורה לזוז באופן אוטומטי בהתאם למיקום בסיס הזנב.
אם מיקום המעקב אינו מיושר עם נקודת העניין בפריים נתון, יישרו ידנית את העיגול הכחול למיקום המעקב. כאשר כל הסרטון נסרק, שמרו את הסרטון ואת שכבת העקיבה (tracing overlay) ובחרו בייצוא לגיליון אלקטרוני (export to spreadsheet) כדי לייצא את נתוני המיקום של העקיבה. בדומה לתוצאות שדווחו בבדיקות דומות, עכברים מסוג mdx חסרי דיסטרופין (dystrophin null) שהוכפפו לפרוטוקול פעילות גופנית מיד לפני הבדיקה, מראים פחות תנועה רצונית באופן מובהק בבדיקת שטח פתוח (open field test) שנמשכה שש דקות, בהשוואה לבעלי חיים מסוג wild type.
ואכן, בעקבות המאמץ המתון של אתגר כוח לחיצה, עכברי mdx נשארו בדרך כלל ללא תנועה במהלך הדקות הראשונות של פרוטוקול הניוד, עם עלייה מתונה בתנועה בדקות ארבע עד חמש. עם זאת, כאשר השווו בין חיות מסוג wild type לבין חיות mdx ללא אתגר של פעילות גופנית, לא נמצאו הבדלים במרחק הנסוע. עכברי mdx טרנסגנביים להבעת utrophin אינם ניתנים להבחנה מחיות wild type, ללא הבדלים משמעותיים במרחק הכולל שנסעו, או בכל אחת מנקודות הזמן המצטברות שנבחנו.
כדי לקבוע את ההשפעה של הפחתת קצב הדגימה, נמדד מרחק הנסיעה הכולל מדקה אחת של וידאו בקצב פריימים מלא, והוא הושווה למדידות המרחק שהופקו מגרסאות עם דגימה מופחתת של סט הנתונים. הפחתת קצב הפריימים בחצי הפחיתה את המרחק שנמדד ב-5% מהמרחק המקורי שחושב. הדיוק של המרחק הנמדד יורד בחדות לאחר נקודה זו, אם כי אפילו סטים של נתונים עם דילול גבוה עדיין מקריבים מקרוב את נתיב בעל החיים, דבר המדגיש את החשיבות של התחשבות בקצב הפריימים ובעיבוד האותים בהערכת פעילות בעלי חיים, ומדגים שניתן לשמר רזולוציה מרחבית גבוהה בנתוני וידאו עם דגימה מופחתת.
לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה של אופן ההקלטה והניתוח של התניידות עכברים בסביבת שדה פתוח (open field). לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים ניתוח זה בתוך 15 עד 30 דקות אם הוא מבוצע כראוי. בדיקה זו, שהיא בעלות נמוכה ואינה פולשנית, מאפשרת לחוקרים לבחון פעילות מוטורית במודלים של עכברים עם דיסטרופיה שרירית, ויכולה לשמש כשלב ראשוני ומידעית למדידות תפקודיות נוספות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר מערכת גמישה וזולה למדידת ניידות של עכברים בבדיקת פעילות בשטח פתוח (open field activity assay). השיטה מספקת מדידה לא פולשנית וניתנת לשחזור של פעילות בעלי חיים, אשר ניתנת להתאמה למסגרות מחקר שונות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- מחקר על דיסטרופיה שרירית
- ניתוח התנהגותי
רקע
- הבדיקה מודדת הליכה רצונית במודלים של עכברים עם דיסטרופיה של השרירים.
- היא נותנת מענה לשאלות מפתח הנוגעות להתקדמות חולשת השרירים.
- הטכניקה נועדה להעריך את היעילות של טיפולים פוטנציאליים.
- ההקלטה מתבצעת בסביבה מבוקרת כדי להבטיח עקביות.
מטרת המחקר
- למדידת תנועה רצונית בעכברי mdx.
- להערכת ההשפעה של התערבויות ספציפיות לשריר.
- לספק תובנות לגבי התקדמות הדיסקלפיה השרירית (muscular dystrophy).
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש במצלמה הממוקמת מעל תא הפעילות לצורך הקלטה.
- ניקוי התא בחומר חיטוי לפני הניסויים.
- מתן אפשרות לעכבר להיאחז במוט כדי למדוד את שיא המתיחות.
- הקלטת פעילות במהלך בדיקה של הליכה למשך 6 דקות.
תוצאות עיקריות
- המערכת מזהה ירידה בתנועה רצונית בעכברי mdx.
- היא מבדילה באופן מדויק בין שיפורים הנובעים מהצלה (rescue) ספציפית לשריר.
- התוצאות ניתנות לשחזור לאורך ניסויים שונים.
- השיטה ניתנת להתאמה למגוון הגדרות מחקר.
מסקנות
- בדיקה זו יעילה לחקר דיסטרופיה שרירית בעכברים.
- היא מספקת נתונים בעלי ערך על היעילות של טיפולים פוטנציאליים.
- הגישה גמישה וניתן להשתמש בה בסביבות מחקר מגוונות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
מדידת הליכה רצונית במודלים של עכברים מספקת מדד תרגומי לתפקוד המוטורי בדיסטרופיה שרירית, באופן האנלוגי ישירות למדדים קליניים כגון מבחן הליכה של 6 דקות. בדיקה זו, המבוססת על וידאו ובעלות נמוכה, מאפשרת הערכה הדירה ולא פולשנית של התקדמות המחלה ותגובה טיפולית במחקרים פרה-קליניים. באמצעות זיהוי גרעונות בפעילות בעכברי mdx חסרי דיסטרופין והשגה של שיפור באמצעות ביטוי אוטרופין, השיטה תומכת בתיקוף של מטרות טיפוליות ובהפחתת סיכונים מכניסטיים בגילוי תרופות למערכת השרירים והעצבים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן השערות טיפוליות על ידי כימות הליכה רצונית כמדד תפקודי לעוצמת השרירים במודלים של דיסטרופיה.
- ערך תפעולי: מאפשר הפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות קורלציה הדירה בין גנוטיפ לפנוטיפ בעכברי mdx לעומת קבוצות של סוג בר (wild-type) וקבוצות שעברו תיקון גנטי.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי הבחנה בין התערבויות יעילות (למשל, טרנסגן utrophin) המנורמלות את רמות הפעילות לרמה של סוג בר.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- מוכנות הבדיקה: הכנת מערכות ביולוגיות מתוקפות לסריקת תרכובות בהמשך התהליך, תוך שימוש במדדי הליכה סטנדרטיים בשטח פתוח (open-field).
- שחזוריות: אספקת פלטים כמותיים המבוססים על מרחק וזמן, המאפשרים סטנדרטיזציה של הבדיקה בין מעבדות שונות.
- יכולת הרחבה: שימוש בתוכנה חינמית ובקוד פתוח ובחומרה נגישה, כדי לאפשר שימוש חוזר בפלטפורמה במסגרות מחקר מגוונות ללא צורך בציוד ייעודי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה ליקויים בניידות הרלוונטיים למטופל, ומספק רצף תרגומי משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מבהיר האם ההשפעות שנצפו נובעות מהצלה ספציפית לשריר לעומת שינויים לא ספציפיים בפעילות.
- החלטות מותאמות סיכון: מספק מידע לקריטריוני go/no-go על ידי מתאם בין התאוששות הניידות לבין מעורבות המטרה ומודולציה של המסלול.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
הבדיקה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי מוביל, ומספקת גשר תפקודי בין מנגנונים מולקולריים לתוצאות פנוטיפיות במודלים של דיסטרופיה שרירית.
- ביולוגיה של התגליות: תומכת בבדיקת השערות על ידי קישור התערבויות גנטיות או פרמקולוגיות לשינויים מדידים בתנועה רצונית.
- סריקה: מאפשרת מוכנות של הבדיקה באמצעות מעקב מבוסס וידאו הניתן לשחזור, המייצר נקודות קצה כמותיות של הליכה לצורך הערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מייצרת זרמי נתונים מיקומיים וזמניים המאפשרים לצוותים להשוות פעילות מוטורית בין גנוטיפים, טיפולים ונקודות זמן.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית על ידי שיקוף של הערכות הליכה קליניות, ובכך מקל על התאמת ביומרקרים ומודלים ניבויים.
- שימוש חוזר בארגון: מבססת יכולת נמוכת עלות וניתנת לשימוש חוזר לבדיקות הליכה, המפחיתה את התלות במכוני ליבה מיוחדים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית במבחני תפקוד מוטורי.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות באמצעות מעקב בקוד פתוח ותנאים סביבתיים מבוקרים.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי ביטול הצורך במערכות מעקב תנועה יקרות, תוך שמירה על איכות הנתונים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאם סיכון, בהתבסס על הצלה פונקציונלית של פנוטיפים של הליכה במודלים פרה-קליניים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בסיסית בהקלטת וידאו ובתוכנות מעקב בקוד פתוח (למשל, יישור ידני פריים אחר פריים).
- תלוי בציוד דימות סטנדרטי ובקרים סביבתיים עקביים (תאורה, טמפרטורה, שעה ביום).
- מחייב הקפדה על פרוטוקול אחיד בין צוותים כדי להבטיח הדירות בין אתרים ומבצעים שונים.
- כולל שיקולי התאמה עבור גדלי תאים שונים, זני עכברים ורמות פעילות שונות.
- כולל פשרות בין קצב הפריימים לבין דיוק המדידה, שכן דגימה מופחתת (downsampling) מפחיתה את הדיוק בחישוב המרחק.
