Functionalization פני השטח של חלקיקי וירוס הפטיטיס E בשיטות כימיות ההטיה
11 במאי 2018
שתכננו את החלבון capsid של וירוס הפטיטיס E כמו ננו-חלקיק theranostic (HEVNP). HEVNP עצמי מרכיבה לתוך כלוב icosahedral יציב במשלוח הרירית. כאן, אנו מתארים את השינוי של HEVNPs לגידול מיקוד על ידי מוטציה השטח החשופים שאריות אל cysteines, אשר נזווג סינתטי ליגנדים שקושרים במיוחד תאים סרטניים.
המטרה הכוללת של פונקציונליזציה כימית של פני השטח של ננו-חלקיקי HEV היא לספק גישה עקבית וניתנת לשחזור לצימוד של מולקולות תרפויטיות, דיאגנוסטיות ואימונוגניות מכוונות לפני השטח של ננו-חלקיקי HEV לצורכי אבחון וטיפול.
שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הננו-רפואה, כגון כיצד ניתן לנטר מיקוד משופר לסרטן והפצה של תרופות ננו-טיפוליות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא בעלת הדירות גבוהה, יעילה וקלה הרבה יותר לביצוע בהשוואה להנדסה גנטית.
את הפרוצדורות יעמידו על כס מישל נגויין ואיבן רואיז, עוזרי מחקר מהמעבדה שלנו.
התחילו פרוטוקול זה בהפקה וניקוי של ננו-חלקיקי נגיף ההפטיטיס E כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט.
דללו את דגימות ננו-חלקיקי ה-HEV לריכוז שבין 0.5 לשני מיליגרם למילליליטר באמצעות MES בריכוז 10 מילימולרי, pH 6.2 לצורך דימוי TEM. יננו את רשתות הפחמן המצופות באמצעות פריקה זוהרת (glow discharge) של 40 מילי-אמפר למשך 30 שניות כדי ליצור פני שטח פחמניים הידרופיליים. פני השטח הפחמניים ההידרופיליים של הרשתות נשמרים למשך 30 דקות בלבד לאחר טיפול הפריקה הזוהרת. לאחר היינון, החזיקו את הרשת והפינצטה והוסיפו שתי מיקרוליטר של דגימת ננו-חלקיקי ה-HEV לרשת.
לאחר 15 עד 30 שניות, ספגו את הרשת באמצעות נייר סינון. לאחר מכן, שטפו מיד את הרשת במים מזוקקים פעמיים וספגו שוב באמצעות נייר סינון. הוסיפו מיד לרשת שני µL של uranyl acetate בריכוז 2%. לאחר 15 שניות, ספגו את הרשת באמצעות נייר סינון. ייבשו את רשתות הדגימה על ידי הנחתן בארון ייבוש עם מסיר לחות אלקטרוני למשך הלילה.
בהתאם לדגימה, מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית או cryo-EM עשויה להיות נחוצה לצורך ויזואליזציה ואפיון של המבנה. העבירו את הרשת ל-TEM ובצעו הדמיה בהגדלה של 10 עד 80K. ננו-חלקיקי HEV מופיעים ב-TEM כחלבונים איקוסאהדרליים ריקים שקוטרם כ-27 nanometers, וזאת בשל היעדר ה-RNA הוויראלי.
כדי לבצע את הצימוד החד-שלבי של ננו-חלקיקי HEV וביוטין מקושר למאליימיד, ראשית העבירו את ננו-חלקיקי ה-HEV ליחידות מיני-דיאליזה. בצעו דיאליזה לננו-חלקיקים כנגד PBS 0.01 molar pH 7.4 בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת, בהתאם לפרוטוקול היצרן. לאחר הדיאליזה, העבירו את ננו-חלקיקי ה-HEV למבחנות של 1.5 milliliter ומדדו את ריכוז החלבון ב-280 nanometers באמצעות ספקטרופוטומטר. ערבבו את הננו-חלקיקים בריכוז של one milligram per milliliter עם כמות שווה של maleimide-biotin בריכוז 100 micromolar ו-PBS 0.01 molar pH 7.4 כדי ליצור יחס מולרי של אחת לחמש. לאחר תגובה למשך לילה בטמפרטורה של ארבע degrees Celsius, הסירו את maleimide biotin שאינו קשור באמצעות תהליך של עמודת spin desalting בהתאם לפרוטוקול היצרן. נתחו את הדגימות באמצעות SDS page מחזר סטנדרטי.
בשימוש בפרוטוקולים הסטנדרטיים, הכינו Western blot כימילומינצנטי באמצעות streptavidin המצומד ל-HRP, ותעו את האות הכימילומינצנטי על סרט רנטגן (X-ray film).
כדי לבצע צימוד דו-שלבי של הליגנד LXY30, הספציפי לתאי סרטן השד, לציסטאין החשוף על פני השטח של ננו-חלקיקי HEV, יש להעביר תחילה את הננו-חלקיקים ליחידות מיני-דיאליזה ולבצע דיאליזה מול PBS 0.01 molar ב-pH 7.4 בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. לאחר מכן, העבירו את ננו-חלקיקי ה-HEV למבחנות של 1.5 milliliter ומדדו את ריכוז החלבון ב-280 nanometers באמצעות ספקטרופוטומטר. בשלב הבא, ערבבו 650 micromolar של maleimide-azide ו-650 micromolar של alkyne-LXY30 עם 200 micromolar של נחושת גסולפט (copper sulfate) ו-one millimolar של חומצה אסקורבית. תהליך זה יוצר maleimide-linked-LXY-30 בריכוז של 650 micromolar. דגרו את התערובת בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך לילה. למחרת, ערבבו את ננו-חלקיקי ה-HEV בריכוז של one milligram per milliliter עם כ-10% נפח של maleimide-linked LXY30 כדי ליצור יחס מולרי של אחת לשלוש. הגיבו למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. בשל הריכוז הגבוה יחסית של maleimide LXY30, הריכוזים הסופיים של המגיבים, כגון נחושת גסולפט, פוחתים בכ-10 פעמים לאחר הערבוב. כדי למנוע נזק לננו-חלקיקי נגיף הדלקת הכבד E, אפשרות נוספת היא שיטת צימוד נטולית נחושת (copper free contribution method).
הסר את maleimide click LXY30 שאינו קשור באמצעות עמודת הסמכה (desalting column) בסיבוב, בהתאם לפרוטוקול היצרן. שמור את ננו-חלקיקי ה-HEV המקושרים ל-LXY30 בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לביצוע צימוד שלב אחד של ננו-חלקיקי LXY30 HEV ותג פלואורסצנטי Cy5.5, ערבב תחילה את הננו-חלקיקים המקושרים ל-LXY30 בריכוז של one milligram per milliliter עם נפח שווה של תג פלואורסצנטי Cy5.5 כדי ליצור יחס מולרי של one to five. לאחר תגובת התערובת למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, הסר את Cy5.5 NHS שאינו קשור באמצעות תהליך של עמודת הסמכה בסיבוב בהתאם לפרוטוקול היצרן. שמור את ננו-חלקיקי ה-HEV המקושרים ל-LXY30 Cy5.5 בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.
שתי שיטות נבחנו עבור פונקציונליזציה של ננו-חלקיקי HEV באמצעות LXY30 למטרת תargeting של תאי גידול. כאשר ננו-חלקיקי HEV 573C נקשרו תחילה ל-maleimide azide, ולאחר מכן בוצעה תגובת click chemistry ל-LXY30 alkyne, נראה כי ננו-חלקיקי ה-HEV 573C התפרקו תחת תצפית TEM. עם זאת, תגובת click chemistry ראשונית בין LXY30-alkyne ל-maleimide-azide ליצירת LXY30 מקושר ל-maleimide, ולאחריה צימוד לננו-חלקיקי HEV שעברו מודיפיקציה, לא השפיעה על המבנה וננו-חלקיקי ה-HEV 573C נותרו שלמים. ננו-חלקיקי HEV מקושרים ל-LXY30 ול-Cy5.5 הוחלו על תאי סרטן שד בתרבית ונצפו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. תמונות פלואורסצנציה בטווח האינפרא-אדום הקרוב במיקרוסקופיה קונפוקלית מעידות כי לננו-חלקיקי HEV מקושרים ל-LXY30 ו-Cy5.5 הייתה זיקה גבוהה יותר לקשירה, שהובילה להגברה של האינטרנליזציה בתאי סרטן שד מסוג MDA MB-231 בהשוואה לננו-חלקיקי HEV מקושרים ל-Cy5.5.
השלכותיה של טכניקה זו חוללות בחינה של מולקולות טיפוליות ומיקוד רב-מודאלי, המאפשרות מיקוד ואבחון מדויקים של גידולים מבלי לגרום נזק לתאים נורמליים. אף ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי סרטן ומיקוד בגידולים באמצעות מודולציה כימית של הפני השטח, ניתן ליישמה לאבחון מוקדם של סרטן, לסריקה ולטיפול מונחה דימות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג הנדסה של חלבון הקפסיד של נגיף ההפטיטיס E לננו-חלקיק תרנוסטי (HEVNP) לטיפול ממוקד בגידולים. ננו-חלקיקי ה-HEVNP שונו כדי לשפר את הדיוק במיקוד לגידול באמצעות הצמדה של ליגנדים סינתטיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ננו-רפואה
- תרנוסטיקה
- אונקולוגיה
רקע
- HEVNPs מרכיבים עצמית מבנים יציבים.
- מודפיקציה של ננו-חלקיקים יכולה לשפר את יכולות התיחום.
- הבנת ההתפלגות של חומרי הטיפול היא קריטית בטיפול בסרטן.
- גישה זו יעילה יותר בהשוואה לשיטות הנדסה גנטית מסורתיות.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה עקבית לפונקציונליזציה של HEVNPs.
- שיפור התargeting של תאי סרטן באמצעות ליגנדים סינתטיים.
- סיוע באבחון ובטיפול בגידולים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ייצור וניקוי של ננו-חלקיקי HEV.
- דילול של דגימות HEVNP לצורך דימוי.
- צמידה של ליגנדים לשארי כייסטאין חשופים על פני השטח.
- שימוש במיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת (TEM) לצורך ניתוח.
תוצאות עיקריות
- ניתן לשנות את HEVNPs ביעילות לצורך התמקדמות בגידולים סרטניים.
- שיטת הצמידה היא יעילה וניתנת לשחזור.
- הוכח מיקוד משופר של תאי סרטן.
- הודגשו יישומים פוטנציאליים לאבחון ולטיפול.
מסקנות
- HEVNPs מהוות פלטפורמה מבטיחה לטיפול בסרטן.
- מודיפיקציה של פני השטח מאפשרת הובלה ממוקדת של חומרים טיפוליים.
- שיטה זו עשויה לקדם את תחום הננו-רפואה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פונקציונליזציה כימית של פני השטח של חלקיקים דמויי-נגיף (virus-like particles) מאפשרת הצמדה מודולרית וניתנת לשחזור של ליגנדים למטרה וחומרי דימות ללא שינוי גנטי, ובכך תומכת בפיתוח מהיר של אבות-טיפוס לנשאי ננו-תרופות (theranostic nanocarriers). גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי באימות המטרה על ידי מתן אפשרות לסריקה שיטתית של ביו-מולקולות מגוונות על פיגום יציב של ננו-חלקיק. השיטה נותנת מענה לאתגר מרכזי בשלב הגילוי: השגת הצגה עקבית וניתנת להרחבה של ישויות פונקציונליות עבור יישומים אונקולוגיים המשכיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות באמצעות הצגה מדויקת של ליגנדים המכוונים לגידול, כגון LXY30, על ננו-חלקיקי HEV.
- ערך תפעולי: מספק פלטפורמה הניתנת לשחזור להערכת אינטראקציות בין ליגנד לרצפטור באמצעות צימוד מכוון לציסטאין.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי מתן אפשרות להשוואה מהירה של זיקה של ליגנדים ויעילות הפנמה במודלים של תאי סרטן.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר ננו-קונג'וגטים כמותיים עם צפיפות ליגנד מוגדרת עבור בדיקות קישור וספיגה סטנדרטיות.
- ערך תפעולי: מאפשר עקביות בין מנות בפונקציונליזציה של ננו-חלקיקים, דבר שהוא קריטי להדירות של הבדיקה.
- יכולת הרחבה: תומך בהכנה של מערכות ביולוגיות מתוקפות לסריקה בתושבה גבוהה (high-throughput screening) של רכיבי תיווך למטרה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: ייצור של HEVNPs המכוונים לגידול (LXY30-HEVNP-Cy5.5) אשר תוקפו במודלים של תאי סרטן השד, מה שתומך בהתקדמות למחקרים פרה-קליניים.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: הדגמה כי יצירה מוקדמת של LXY30 מקושר במאלימיד באמצעות כימיית קליק שומרת על שלמות הננו-חלקיק, ובכך מפחיתה את הסיכון לכשל מבני.
- מערכת רלוונטית למחלה: שימוש בתאי MDA-MB-231 להערכת הפנימה (internalization) ואפיניות הקישור, בהתאמה לרלוונטיות טיפולית בסרטן שד טריפל-נגטיב.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי מוביל, ומאפשרת הכנה של נשאים ננומטריים פונקציונליים לצורך הערכה פרה-קלינית.
- ביולוגיית גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על ידי מתן אפשרות לצימוד מודולרי של מולקולות אימונוגניות, טיפוליות ואבחנתיות לננו-חלקיקי HEV.
- סריקה: מספק ננו-חלקיקים מוכנים לבדיקה עם מודיפיקציה שרירית הניתנת לשחזור לצורך הערכה כמותית של יעילות התargeting.
- אנליטיקה: מייצר תוצאים מדידים באמצעות TEM, Western blot ומיקרוסקופיה קונפוקאלית להשוואת הצלחת הצימוד והספיגה התאית.
- מחקר תרגומי: מקשר בין הגילוי לרציפות פרה-קלינית באמצעות הדגמה של קישור ספציפי לגידול והפנמה בתאי סרטן מתרחב.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמת צימוד לשימוש חוזר, הישימה למסלולים של קומפלקסים מקרו-מולקולריים אחרים עם מבנים ידועים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בתיקוף המטרה באמצעות הצגה מדויקת וספציפית לציסטאין של ליגנדים, מבלי לשנות את הרכבת הננו-חלקיקים.
- ערך תפעולי: מציע הדירות ויעילות גבוהות בהשוואה להנדסה גנטית, ובכך מפחית את השונות בין סדרות ייצור.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך פיתוח (go/no-go) על ידי מתן אפשרות לסריקה מהירה של ליגנדים ותגי דימוי על נשאי ננו יציבים.
- השפעה על הפורטפוליו: מקל על קידום מותאם סיכונים באמצעות יצירת מועמדים תרנוסטיים עם יכולות מאומתות של דימוי ומיקוד בגידול.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בכימיה של חלבונים, בטכניקות קשירה (conjugation) ובטיהור ננו-חלקיקים.
- תלוי בגישה ליחידות דיאליזה, ספקטרופוטומטריה, SDS-PAGE, Western blotting ומיקרוסקופיה קונפוקלית.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים למדידה עקבית של ריכוז החלבון ותנאי תגובה.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום השיטה על מערכות ננו-חלקיקים אחרות עם שאריות שונות החשופות על פני השטח.
- כולל מגבלות מעשיות כגון פירוק של ננו-חלקיקים אם סדר הקשירה אינו אופטימלי, כפי שנראה בקישור מוקדם של maleimide azide.
שאלות נפוצות בביו-פארמה
Chapters in this video
0:04
Title
0:50
HEVNP Characterization
2:46
Chemical Conjugation of HEVNPs with Biotin, Cancer Targeting Ligand, and Fluorophores
7:05
Results: Production of LXY30-HEVNPs and Binding/Internalization of Fluorescently Labeled LXY30-HEVNPs in MDA-MB-231 Breast Cancer Cells
8:35
Conclusion
