פרוטוקול עבור סימן ובדיקות כרונית Ecotoxicity של דגים גמבוזיים טורקיז Nothobranchius furzeri

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לחקור את ההשפעות של חומרים רעילים על דג הטורקיז Nothobranchius furzeri. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האקוטוקסיקולוגיה, כגון ההשפעות ארוכות הטווח של גורמי לחץ על תכונות חשובות בהיסטוריית החיים, זמן התבגרות, גדילה או פוריות. היתרון העיקרי של הניסוי הזה הוא שאנו משתמשים בבעלי חוליות עם מחזור חיים מהיר מאוד, מה שמוביל לניסויים חסכוניים בזמן ובעלות-תועלת.

דגי קיליפיש אלה הם מודלים אידיאליים לחקר ההשפעה של השפעות ארוכות טווח ורב-דוריות של גורמי לחץ. בסופו של דבר, הם יתרמו להבנה טובה יותר של ההשפעה הסביבתית של חומרים רעילים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות חדשות לגבי ההשפעות המשולבות של חומרים רעילים וטמפרטורה, ניתן ליישם אותה גם על גורמי לחץ אחרים כגון קרינת UV, חסך מזון ושינויים ב-PH.

קשה לעבוד עם קיליפיש, מכיוון שהם מערכת מודל חדשה באקוטוקסיקולוגיה, ומכיוון שהם רגישים להרבה מזהמים עדיין לא ידועים. פיתחנו את הרעיון לשיטה הניסיונית הזו כשלמדנו לראשונה על תוחלת החיים הקצרה יוצאת הדופן של דגי הקיליפיש, ועל יכולתם לייצר ביצים רדומות שיכולות להיות מאוחסנות במשך שנים על המדף. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שסוג הניסוי, כמו גם הטיפול באנשים, יכולים לשנות את התוצאות.

כדי להתחיל, בחר גן חיות גונה ריי, או ביצי GRZ, בשלב D3, הניתנות לזיהוי על ידי נוכחות של עיני זהב. והשתמש בפינצטה רכה כדי להעביר אותם בעדינות למיכל פלסטיק של שני ליטר. הוסף סנטימטר אחד ממדיום הבקיעה ב -12 מעלות צלזיוס, ותן לטמפרטורת המים להסתגל בהדרגה לטמפרטורת החדר.

לאחר 24 שעות, האכילו את האבקועים במינון מרוכז של ארטמיה נאופלי שזה עתה בקע, והגדילו את עומק המים לחמישה סנטימטרים על ידי הוספת מדיום דגים. 48 שעות לאחר הבקיעה, העבירו זחלים בריאים וצפים למיכלים בודדים עם מדיום חשיפה, וריכוזי חומרים רעילים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. בכל בוקר וערב, בדוק דגים לתמותה, מתח ומחלות, וחשב ערכי LC50 לפי פרוטוקול הטקסט.

בצע ניסוי חשיפה כרונית על ידי מילוי מיכלים בודדים במדיום החשיפה הנכון, והוסף צינור אוויר לאוורור הצנצנת. מעבירים דגים לצנצנות למשך שארית הניסוי. בין יומיים ל -23 ימים לאחר הבקיעה או DPH, האכילו את הדג ארטמיה נאופלי פעמיים ביום עד הסוף

לאחר מכן, לאחר השלמה עם זחלי כירונומוס קצוצים עד 37 DPH, השתמש בזחלי כירונומוס קפואים כדי להאכיל את הדגים אד ליביטום פעמיים ביום, כל יום, קדימה. כדי לקבוע את הצמיחה, מדדו את גודל הגוף על בסיס שבועי, על ידי העברת דגים לצלחת פטרי מלאה במדיום מהמאגר. צלם ארבע עד חמש תמונות גב מכוילות בגודל של הדג בגובה קבוע.

והשתמש בתוכנת מדידה מרחבית כדי לנתח אותם דיגיטלית. מ-15 DPH ואילך, בדוק ויזואלית את הדג הזכר לצבע, כדי לקבוע את ההתבגרות. בדוק את הסנפירים לאיתור הסימנים הראשונים לצבע הנישואין, והשתמש ביום שבו צבע האגרוף נראה כמייצג את זמן ההתבגרות הגברי.

מ-30 DPH ואילך, בדוק את הפוריות על ידי הקמת מיכל השרצה של ליטר אחד לזוג זכר ונקבה בוגרים בכל טיפול, תוך שימוש במדיום חשיפה מהאקווריום של הזכר, והשלים אותו עם מצע השרצה. העבירו גם את הזכר וגם את הנקבה למיכל ההשרצה. ותוך מזעור פעילות אנושית או הפרעה סביב מיכלי ההשרצה, אפשרו להם להשריץ במשך שעתיים.

לאחר מכן, ללא ערבוב מיותר של המים, שיסחררו את הביצים במצע ההשרצה, העבירו בעדינות את הדגים בחזרה למיכלי הדיור המקוריים שלהם. סננו את הביצים על ידי שפיכת מצע ההטלה על רשת של 500 מיקרומטר. סופרים את הביצים ומשתמשים בפיפטה, כדי להעביר אותן לטחב כבול לח בצלחות פטרי.

הסר ביצים מתות מדי יום. לאחר שבוע, השתמש בסרט איטום כדי לאטום את צלחת הפטרי. ולאחסן אותו באינקובטור מבוקר טמפרטורה בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס, עם מחזור של 14 עד 10 אור לחושך, להתפתחות מיידית לשלב D3.

לשימור ארוך טווח, יש לאחסן את הביצים בחושך מתמיד בטמפרטורה של 17 מעלות צלזיוס, ואז הביצים נכנסות לשלב הרדום, ונשארות ברות קיימא למשך מספר שנים. כדי לגייס דגים מהביצים הרדומות, העבירו את הביצים ל-28 מעלות צלזיוס, ומחזור של 14 עד 10 אור לחושך, למשך כשלושה שבועות, כדי לאפשר להן להתפתח לשלב D3. כדי למדוד את המקסימום התרמי הקריטי, או CT max של דגים בוגרים, התחל באמבט מים במחזור רציף, המחומם בקצב קבוע של 0.33 מעלות צלזיוס לדקה.

הוסף כמה אקווריומים של ליטר אחד, לכל דג בודד. התחל את השביל על ידי הוספת הדגים לאקווריום, כאשר המים הגיעו לטמפרטורת הגידול הניסיונית של הדגים. השתמש במדחום דיגיטלי כדי לנטר את הטמפרטורה באקווריומים של ליטר אחד של אמבט CT max, כל חמש דקות.

כאשר הדג לא מצליח לשמור על מיקום זקוף גחוני גבי, או מתחיל להתעוות בכבדות, מדוד את הטמפרטורה באקווריום של ליטר אחד, שהיא הטמפרטורה המקסימלית הקריטית. לאחר מכן, העבירו את הדג בחזרה לבית הניסוי שלו לצורך התאוששות. כפי שמוצג בגרף זה, חשיפה חריפה של אנפורזרי לריכוזים שונים של נחושת, גרמה לעלייה בתמותה עם עלייה בריכוז הרעילים.

ערכי LC50 יורדים עם הזמן, כלומר עם ירידה בריכוזים, עובר יותר זמן לפני ש-50% מהשכפולים מתים. בבדיקת חשיפה כרונית, באמצעות נחושת שמקורה במים, הדגים קצרים יותר באורכם, כפי שנמדד לאחר שלושה שבועות כאשר גדלו בריכוז הגבוה ביותר שנבדק. בניסוי זה באמצעות כלורפיריפוס הנישא במים או CPH, כאשר גדלו ב-28 מעלות צלזיוס, דגים ייצרו פחות ביצים כאשר נחשפו לריכוז הגבוה ביותר של CPF, אולם ב-30 מעלות צלזיוס, דגי ביקורת ייצרו יותר ביצים מאשר דגים שנחשפו לאחד מהריכוזים של CPF, מה שמצביע על כך שהשילוב של CPF ועלייה בטמפרטורה השפיע על הפוריות יותר מכל גורם לחץ בנפרד.

מדווח כאן הוא הגיל הממוצע שבו הופיעו סימני הצבע הראשונים אצל זכרי enfurzeri, שנחשפו ל-CPF ב-28 ו-30 מעלות צלזיוס. לאחר חשיפה לארבעה מיקרוגרם לליטר של CPF, לדגים הזכרים לקח 18% יותר זמן להתבגר מאשר לדגי הביקורת. מדידת ה-CT המקסימלי של דגים שגודלו ב-24 או 28 מעלות צלזיוס, וחשיפה למזהם 3, 4-DCA העלתה כי שחייה לא יציבה, תנועה אופרקולרית מוגברת ואובדן היכולת להישאר במצב זקוף גב-וונטרלי, התרחשו בטמפרטורה נמוכה יותר כאשר דגים גודלו ב-24 מעלות צלזיוס.

לאחר השליטה בפרוטוקול זה, כולל ההשפעות על הפוריות, ניתן למדוד תוך חודשיים. כדי למדוד את ההשפעות על כל תקופת הרבייה או אפילו על הדור הבא, ניתן להאריך את הפרוטוקול, אך עדיין ניתן לבצע אותו תוך שישה חודשים.