מדידת רמות פעילות גופנית ב- דרוזופילה melanogaster באמצעות מערכת כימות בתרגיל סיבוב (REQS)
27 במאי 2018
סיבוב תרגיל כימות מערכת (REQS) יכול לגרום תרגיל דרוזופילה melanogaster באמצעות סיבוב בעוד בו-זמנית מדידת כמות הפעילות המבוצעת על ידי בעלי החיים. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול נקודה-מאת-נקודת המפרט כיצד למדוד רמות הפעילות של חיות חווה תרגיל סיבובי טיפולים באמצעות את REQS.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של המאמץ, כגון כיצד תגובת הפעילות הגופנית שונה עבור בעלי חיים בגילאים שונים ואילו מסלולים גנטיים שולטים בתגובה לפעילות גופנית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לחוקרים, בפעם הראשונה, למדוד פעילות בזבובים המבצעים פעילות גופנית המושרה על ידי סיבוב בזמן אמת. מי שידגים את ההליך יהיה לואיס פטריק ווטאנבה, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי.
לפני הניסוי המתוכנן, הקימו הכלאות של זבובים זכרים ונקבות כך שניתן יהיה לאסוף כל צאצא מבוקר לניסוי. כדי להתחיל, טען שמונה צינורות דגימת זכוכית עם 10 זבובי בדיקה מורדמים לכל בקבוקון. קבוצת ניסוי סטנדרטית מורכבת מ-10 בקבוקונים של 10 זבובים מכל מין.
כדי להעמיס את הבקבוקונים לתוך ה-REQS, הכנס את הבקבוקון לחריץ של צג הפעילות מלפנים. לאחר מכן, הניחו את המכסה השני על הבקבוקון ומרכזו את הבקבוקון, והזיזו את טבעת ה-O לפי הצורך. שכן את ה-REQS בחממה לתנאי סביבה מבוקרים.
אפשר לבעלי החיים להתאושש מההרדמה למשך שעה בחממה זו לפני שתמשיך. עבור בדיקות של יותר משמונה שעות, ניתן להשתמש בבקבוקונים המכילים מזון המחובר היטב לקצה אחד של הצינור. לאחר תקופת ההתאקלמות, הפעל את המכשיר כדי להתחיל את הסיבובים.
התאם את המהירות למהירות הרצויה, כגון ארבעה סל"ד. אף צינור לא אמור ליצור מגע עם המשטח התחתון אם הם ממוקמים כראוי. לבדיקה טיפוסית, פשוט הפעל את התוכנה והקלט את הפעילות למשך הזמן הרצוי, כגון במשך שעתיים בעת שימוש בבקבוקונים ללא אוכל.
עם ההפעלה, התוכנה שומרת אוטומטית את הנתונים בקובץ טקסט. בתוכנה, נורית חיבור ירוקה מציינת שהתוכנה אוספת נתונים. ניתן לכוונן את תדירות ההקלטה תחת העדפות הכרטיסייה.
בדרך כלל, משתמשים במרווחים של חמש דקות. במהלך הבדיקה, אל תפתח את האינקובטור, מכיוון שבעלי החיים רגישים מאוד לכל הפרעה ועשויים להגיב בפעילות מוגברת. בסיום הבדיקה, סיים את איסוף הנתונים על ידי סגירת התוכנה, ולאחר מכן כבה את ה-REQS ובדוק את הצינורות.
שימו לב לכל מקרי המוות שהתרחשו במהלך משטר התרגילים. בדרך כלל, ארבעה סל"ד למשך שעתיים אינם קטלניים לזנים בריאים. לבסוף, פרקו את הבקבוקונים על ידי הרדמת הזבובים בפחמן דו חמצני.
ניתן לנתח את קובץ הנתונים בכל חבילה סטטיסטית. אם יש נקודות זמן שבהן נרשם ציון פעילות של אפס עבור כל העמדות, אז היה ניתוק בחיבור במהלך נקודות הזמן הללו. אם מתרחשים חתכים, ייצב את החיבורים המובילים לשקע הטלפון המסתובב באמצעות סרט.
ארבעה קווי דרוזופילה נבדלים גנטית נבדקו עם ה-REQS באמצעות הפרוטוקול המתואר. כל קבוצה הורכבה מ-100 זבובים שחולקו ל-10 בקבוקונים. הפעילות הממוצעת חושבה בפחים של חמש דקות במהלך הבדיקה בת השעתיים, שנערכה בארבעה סל"ד.
פעילות הפעילות הגופנית הממוצעת בין כל ארבעת הגנוטיפים הייתה שונה באופן משמעותי, עם זאת, לא נמצא הבדל משמעותי בין זבובים זכרים בתולים לנקבות בתולות, ולכן הנתונים שלהם מוצגים יחד בניתוח זה. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הגנטיקה של פעילות גופנית לחקור תגובות פעילות גופנית שונות בדרוזופילה מלנוגסטר וחקרו את השפעת הפעילות הגופנית על התנהגות ופיזיולוגיה של בעלי חיים. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון ניתוח הרכב הגוף, מבחני מאמץ ומבחני כושר כדי לענות על שאלות נוספות לגבי ההשפעות של טיפולי פעילות גופנית על בעלי החיים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מערכת כימות פעילות גופנית סיבובית (REQS) מאפשרת השראה של פעילות גופנית ב-Drosophila melanogaster באמצעות סיבוב, תוך כדי מדידת רמות הפעילות שלהן. פרוטוקול זה מספק גישה מפורטת להערכת הפעילות של זבובים העוברים טיפולי פעילות גופנית סיבובית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של מאמץ גופני
- ניתוח התנהגותי
- מסלולים גנטיים
רקע
- הבנת התגובה לפעילות גופנית בקבוצות גיל שונות.
- חקירת מסלולים גנטיים המשפיעים על התגובה לפעילות גופנית.
- מדידה בזמן אמת של פעילות בזבובים במהלך פעילות גופנית.
- שימוש ב-REQS עבור מערכים ניסיוניים.
מטרת המחקר
- למדידת רמות הפעילות ב-Drosophila במהלך אימון סיבובי.
- לבחינת השאלה כיצד תגובת האימון משתנה בהתאם לגיל ולגנטיקה.
- לספק פרוטוקול המאפשר לחוקרים לשחזר את המחקר.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הקמה של הכלאות בין זכרי ונקבי Drosophila.
- הכנסת זבובים מושןשים למבחנות דגימה מזכוכית.
- קבוצת ניסוי סטנדרטית המורכבת ממספר מבחנות עם זבובים.
- ניטור בזמן אמת של הפעילות במהלך אימון סיבובי.
תוצאות עיקריות
- השראה מוצלחת של פעילות גופנית ב-Drosophila באמצעות REQS.
- איסוף נתונים בזמן אמת על רמות הפעילות של הזבובים.
- תובנות לגבי הבדלים הקשורים לגיל בתגובה לפעילות גופנית.
- זיהוי של מסלולים גנטיים המשפיעים על התנהגות של פעילות גופנית.
מסקנות
- ה-REQS הוא כלי בעל ערך לחקר ביולוגיה של פעילות גופנית ב-Drosophila.
- מדידה בזמן אמת משפרת את ההבנה של תגובות לפעילות גופנית.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על מתודולוגיה זו כדי לבחון השפעות גנטיות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
כימות פעילות המושרה על ידי פעילות גופנית ב-Drosophila melanogaster באמצעות מערכת כימות פעילות גופנית מסתובבת (REQS) מאפשר מדידה מדויקת של פנוטיפים התנהגותיים הרלוונטיים למחקרים גנטיים ופיזיולוגיים. יכולות זו תומכת בתיקוף יעדים בשלבים מוקדמים ובצמצום סיכונים מכניסטיים בקווי גילוי המתמקדים בביולוגיה של פעילות גופנית, ויסות מטבולי וגנטיקה התנהגותית. פלטים כמותיים וסטנדרטיים מ-REQS מקלים על השוואות בין זנים ובין תנאים שונים, ובכך מגבירים את הביטחון החזוי עבור מחקרים תרגומיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה של מסלולים גנטיים ופיזיולוגיים העומדים בבסיס התגובה לפעילות גופנית במודל ניתן לניתוח.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי כימות שינויים בפעילות בין גנוטיפים, מינים ומשתנים ניסויים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי אספקת נתונים התנהגותיים כמותיים בזמן אמת.
- משפר את הביטחון החזוי למחקרים המשכיים על ידי סטנדרטיזציה של החשיפה לפעילות גופנית בין הקבוצות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין בדיקות התנהגותיות מהימנות וניתנות לשחזור לצורך סריקת תרכובות או סריקה גנטית ב- Drosophila.
- מספק נתוני פעילות כמותיים ובעלי רזולוציית זמן המתאימים לניתוח בסריקה רחבה (high-throughput).
- מאפשר סטנדרטיזציה של הבדיקה ויכולת שחזור בין הרצות ניסיוניות וצוותי מחקר שונים.
- תומך בסריקה ניתנת להרחבה של משנה-פעילות (modifiers) של פעילות המושרה על ידי פעילות גופנית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם פנוטיפים הרלוונטיים למחלה, כגון ויסות מטבולי ותגובה למאמץ (stress response), כאשר הדבר נתמך על ידי בדיקות המשך (downstream assays).
- מספק רצף מגילוי גנטי ועד לתיקוף פרה-קליני באורגניזמי מודל.
- מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאם סיכונים באמצעות הבהרת הקשרים בין גנוטיפ לפנוטיפ.
- תומך בהפחתת סיכונים חזויה (predictive de-risking) לפיתוח ביומרקרים תרגומיים כאשר הוא משולב עם נקודות סיום (endpoints) נוספות.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטת ה-REQS משתלבת ברצף הגילוי המוקדם, ומגשרת בין מניפולציה גנטית, פנוטיפ עיגון התנהגותי ופיתוח מודלים פרה-קליניים בביולוגיה של פעילות גופנית ובתחומים קשורים.
- ביולוגיה של התגליות: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי כימות פעילות המושרה על ידי פעילות גופנית על רקעים גנטיים שונים.
- סריקה: מספקת תוצרי התנהגות הניתנים לשחזור ומוכנים לבדיקה לצורך הערכת תרכובות או מודיפיקטורים גנטיים.
- אנליטיקה: מייצרת נתוני פעילות כמותיים בחלונות זמן, המאפשרים השוואה סטטיסטית חסונה של קבוצות ניסוי.
- מחקר תרגומי: מאפשר התאמה למדדי קצה רלוונטיים למחלה כאשר השלב משולב עם בדיקות פיזיולוגיות או בדיקות של סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה סטנדרטית וניתנת לשימוש חוזר לצורך פנוטיפ של התנהגות בתיקי מחקר של Drosophila.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בשלב המוקדם של תיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מספק בדיקות התנהגותיות סטנדרטיות, הניתנות לשחזור ובעלות יכולת הרחבה לשימוש חוצה-צוותים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך התקדמות (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי הבהרת קשרי גנוטיפ-פנוטיפ.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון וקידום של מטרות גנטיות או פרמקולוגיות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיפול ב- Drosophila, בתכנון בדיקות התנהגותיות ובניתוח סטטיסטי.
- נדרשת גישה למכשיר ה-REQS, לתוכנה תואמת לניטור פעילות ולתנאים סביבתיים מבוקרים.
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרמטרי הבדיקה ושל זרימות העבודה לניתוח נתונים.
- עשוי לדרוש התאמה עבור זני זבובים שונים, גילאים שונים או משתנים ניסיוניים שונים.
- מגבלות פוטנציאליות כוללות רגישות להפרעות סביבתיות וצורך ביציבות חזקה של חיבור הנתונים.
