Benchtop. מרותק למיטה כרומטוגרפיית זיקה מתכת, שיחזור ותייגת וזמינותו של Polyhistidine Metalloenzyme עבור המעבדה לתואר ראשון

שיטה זו מאפשרת לסטודנטים לתואר ראשון לטהר במהירות מטאלואנזימים קושרי ברזל ולאחר מכן להשתמש בחלבון זה כדי לענות על שאלות מפתח על מבנה ותפקוד, הכל בגבולות מעבדת ההוראה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא ישימה לאנזימים קושרי ברזל שאינם הם. הוא נגיש לסטודנטים לתואר ראשון, והוא מיושם בקלות במעבדת ההוראה.

כדי להתחיל בהליך זה, השג עמודה בגודל 1.5 על 20 סנטימטר המצוידת בשקע נעילת לואר, מכסה עליון המכיל גם אביזר נעילת לואר ותמיכת מיטה תחתונה לשמירה על חלקיקי שרף. התקן את אביזר נעילת הלואר התחתון עם תא עצירה כדי לשלוט בזרימה. לאחר מכן, השג בקבוק המכיל 50% slurry של שרף חומצה ניטרילואצטית הקשור לניקל ב-20% אתנול שאוחסן בעבר בארבע מעלות צלזיוס.

סובב בעדינות את הבקבוק כדי להשעות מחדש את השרף באופן שווה. בעבודה בטמפרטורת החדר, השתמש בפיפטה מדורגת כדי למשוך שני מילימטרים מהשפלה ולהעביר אותה לעמוד. לאחר שתמיסת האחסון העודפת מתנקזת מהשרף, השתמש בפיפטה של פסטר כדי להוסיף בזהירות לפחות 30 מיליליטר של מאגר קשירת ליזה צונן, והקפד לא להפריע למשטח השרף.

הפעל את המאגר במורד קירות העמוד כדי למנוע התזות. אזנו את השרף על ידי מתן אפשרות למאגר להתנקז לאט מהעמוד על ידי כוח הכבידה לכוס איסוף. כדי להתחיל, הכן את עמודת הניקל-NTA להוספת תמציות הנפט הגולמי נטולות התאים על ידי פתיחת תא העצירה ומתן אפשרות למאגר קשירת הליזיס הנותר להתנקז על ידי כוח הכבידה דרך שרף הניקל-NTA.

כאשר המאגר התרוקן לחלוטין ומשטח השרף חשוף, סגור את תא העצירה. לאחר מכן, השתמש בפיפטה של פסטר כדי לפזר בזהירות את התמציות הגולמיות נטולות התאים על השרף, תוך הקפדה לא להפריע לפני השטח. העבירו את התמציות הגולמיות במורד קיר העמוד כדי למנוע התזות.

לאחר שכל התמציות הגולמיות הועברו לעמוד, פתח את תא העצירה כך שהעמוד יוכל להתנקז על ידי כוח הכבידה. אסוף 100 מיקרוליטר מהזרימה לניתוח מאוחר יותר. השתמש באורך קצר של צינורות פלסטיק כדי לחבר מזרק נעילת לואר 10 מיליליטר למכסה העמוד.

משוך החוצה את בוכנת המזרק ואז מלא היטב את מכסה העמוד על החלק העליון של העמוד. דחוס בעדינות את הבוכנה תוך איסוף חומר הניקוי לתוך גליל מדורג כדי להעריך ידנית את קצב הזרימה. קצבים בין מיליליטר לשני מיליליטר לדקה תואמים לשרף ולמערך הניסוי.

הגדל בעדינות את הדחיסה של בוכנת המזרק ככל שקצב הזרימה מאט. כאשר המניסקוס של הנוזל המיושם מגיע לחמישה עד 10 מיליליטר מעל מצע השרף, הסר את מכסה העמוד ואת משאבת היד המחוברת כדי למנוע הכנסת אוויר לשרף. תן לנפח הנותר להתנקז על ידי כוח הכבידה.

לאחר שהתמציות הגולמיות סיימו להתנקז ומשטח השרף נחשף שוב, השתמש בפיפטה של פסטר כדי להוסיף בזהירות כ -30 מיליליטר של מאגר כביסה צונן לעמוד, והקפיד לא להפריע למשטח השרף. פתח את תא העצירה ותן למאגר הכביסה להתנקז דרך העמוד. בזמן שהעמוד מתנקז, סמן 16 צינורות מיקרו-צנטריפוגה לאיסוף שברים.

כאשר המאגר התנקז לחלוטין ומשטח השרף נחשף שוב, סגור את תא העצירה. בעזרת פיפטה של פסטר, הוסיפו בזהירות כ -30 מיליליטר של מאגר פליטה צונן לעמודה, והקפידו לא להפריע למשטח השרף. לאחר מכן, פתח את תא העצירה באיטיות כדי לאפשר למאגר הפליטה לחלץ את החלבון המתויג בפוליהיסטידין מהעמודה.

אסוף מיליליטר אחד של חומר נוזל בכל אחד מצינורות המיקרו-צנטריפוגה המסומנים. לאחר בדיקת חלבון, שלב את השברים המכילים חלבון לצינור חרוטי נקי. המשך בבנייה מחדש של קופקטור יון המתכת, או הקפיא את החלבון בשלושה מיליליטר בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס.

כדי להתחיל בבנייה מחדש של המתכת, הניחו על קרח כמות של שלושה מיליליטר של האנזים המטוהר, התלוי במאגר פליטה. בעזרת נפח החלבון בצינור, חשב את כמות הנתרן אסקורבט ודיתיותרייטול הדרושים כך שהריכוז הסופי של כל אחד מהם יהיה 12.5 מילימולר בדגימה. יש להוסיף את הנתרן אסקורבט המוצק ואת הדיתיותרייטול, ולערבב בעדינות אך ביסודיות עד להמסה מלאה.

הקש כמה גרגירים של מיליליטר אחד של ברזל גופרתי מוצק הפטהידרט החוצה על פיסת נייר שקילה. מקפלים את הנייר על הגרגיר ומועכים אותו עם הצד השטוח של מרית מתכת. הוסף גרגר מהאבקה המתקבלת לצינור המכיל את תמיסת החלבון.

מערבולת לערבב, וכתוצאה מכך צבע ורוד-ורוד. מכסים את הצינור, ודוגרים את התמיסה הוורודה על קרח למשך 10 עד 30 דקות. הצבע הוורוד ידהה עם הזמן.

לסינון ג'ל, השתמש בעמוד סינון ג'ל ארוז ב -10 מיליליטר ג'ל פוליאקרילאמיד כדורי בעמוד בגודל 1.5 על 12 סנטימטר, המצויד גם במאגר של 10 מיליליטר. לאחר מכן אזן את העמודה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כאשר המאגר התנקז מהעמוד ותמיכת המיטה העליונה נחשפת, סגור את תא העצירה.

פיפטה, תמיסת שלושה מיליליטר של ברזל שניים שיחזרו את המטאלו-אנזים על תמיכת המיטה העליונה החשופה. פתח את תא העצירה ותן לכל דגימת שלושת המיליליטר להיכנס לעמודה על ידי כוח הכבידה. השלך את שלושת המיליליטר הראשונים של נוזל.

כל צבע ורוד שנוצר בזמן הטיפול בתמיסה יילכד בחלק העליון של העמודה. כאשר העמודה הפסיקה לטפטף ותמיכת המיטה העליונה נחשפת, הוסף ארבעה מיליליטר ממאגר סינון הג'ל, ואסוף ארבעה מיליליטר נוזל על פני 8.5 שברים של מיליליטר. לאחר שילוב שברים המכילים חלבון, המשך בבדיקה או באחסון של הדגימה כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

במחקר זה, התלמידים טיהרו ולאחר מכן הרכיבו מחדש דיאוקסיגנאז קושר ברזל שאינו הם. ניתוח SDS-PAGE מראה כי החלבון המתויג מטוהר ביעילות. נתוני פעילות שנאספו על ידי סטודנטים על הפעולה האנזימטית של L-dopa dioxygenase מטוהר לאחר בנייה מחדש עם ברזל 2 וסינון ג'ל לאחר מכן מוצגים כאן.

הפיגור של חמש השניות לפני תחילת איסוף הנתונים אופייני לתלמידים המבצעים טכניקה זו בפעם הראשונה. בדיקת המצב היציב מצביעה על כך שהפרמטרים הקינטיים, כפי שנקבעו על ידי התאמת עקומות ההתקדמות, עולים בקנה אחד עם התוצאות שפורסמו. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שיותר ברזל אינו טוב יותר, מכיוון שיותר מדי ברזל יגרום למשקעי חלבון.

ריכוזי ברזל בעודף של שלוש עד חמש טוחנות של החלבון מספיקים. בעקבות הליך זה, התלמידים יכולים לבצע ניסויים נוספים למדידת מבנה התמיסה, להסתכל על כימיה תלוית אנזים או סובסטרט, הכל כדי לענות על שאלות נוספות על מנגנון התגובה.