סוג משנה ספציפי פוטנציאל הפעולה אופטי הקלטות-אנוש המושרה Cardiomyocytes חדרית נגזר תאי גזע Pluripotent

קרדיומיוציטים המופקים מגבעול פלוריפוטנטי המושרה או תאי IPS משמשים יותר ויותר כדי לענות על מגוון רחב של שאלות ביולוגיות בתחום האלקטרופיזיולוגיה הלבבית. היתרונות העיקריים של טכנולוגיה זו הם שהיא מאפשרת עלייה דרמטית בתפוקה, כמו גם הקלטות ספציפיות לפעולה תת-סוג בחדרי חדרים כמו מיוציטים, באמצעות אלמנט מקדם ספציפי חדרית. כניסתם של חיישני מתח מקודדים גנטית באמצעות התמרה lentiviral מאפשר הדמיה אופטית של תאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי האדם נגזרים קרדיומיוציטים פוטנציאל פעולה.

התחל על ידי ערבוב lentivirus המכיל תרבות תאים על טבעי עם אמצעי תחזוקה cardiomyocyte, ביחס אחד לאחד. הוסף ברומיד hexadimetherine בריכוז סופי של 8 מיקרוגרם למיליליטר, כדי לשפר את יעילות הזיהום. ולהחליף את אמצעי התחזוקה cardiomyocyte בצלחת תרבות cardiomyocytes נגזר תא IPS, עם מדיום זיהום.

תרבות קרדיומיוציטים נגועים במשך 12 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, ולהחליף את מדיום הזיהום עם אמצעי תחזוקה קרדיומיוציטים טריים. לפני הדמיה, להחליף את מדיום תרבות התא עם הפתרון של טירודה, בתוספת סידן. לאחר מכן מניחים את הקרדיומיוציטים בתא הדמיה על הבמה של מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי הפוך המצויד במפצל תמונה.

אם נדרש צעידה חשמלית, התקינו אלקטרודות צועדות בתא ההדמיה וחברו את האלקטרודות לגנרטור גירוי. הכניסו את התאים לפוקוס, ואתרו תא המבטא את מחוון המתח המקודד גנטית במרכז שדה הצפייה. הגדר את הנתיב האופטי כך שהאור הנפלט ינותב למפצל התמונה והחלק את קוביית המסנן במיקרוסקופ לנתיב שישולב עם המסננים במפצל התמונה.

בתוכנה השולטת במצלמה, הגדר את הגדרת הרכישה כך שניתן יהיה לבצע הדמיה במהירות גבוהה, והגדר את מפצל התמונה בהתאם להוראות היצרן. שתי התמונות המייצגות את שתי רצועות אורך הגל השונות של הפליטה צריכות להיות סמוכות זו לזה, כאשר כל אחת מהן תופסת מחצית אחת של התמונה. בדוק והתאם את מוקד התמונה המיוצרת על-ידי המצלמה לפי הצורך.

והתאימו את בהירות אור התאורה כך שתמנעו את רוויית הפיקסלים. הגדר את רכישת סדרת הזמן ועמעם את האור בחדר כדי למנוע אור תועה המשפיע על המדידה. לאחר מכן פתח את תריס אור העירור והתחל ברכישת סדרת התמונות, החל את ההליכה החשמלית בנקודת הזמן המתאימה, בהתאם לצורך ניסיוני.

לאחר סיום הרכישה, סגור את תריס אור העירור לפי הצורך ושמור את ההקלטה בכונן הקשיח. לאחר מכן, השארת הגדרת ההקלטה ללא שינוי, הקלט את הרקע מעל אזור של הכיסוי ללא תאים. לניתוח ההקלטות הפוטנציאליות של הממברנה האופטית, פתחו את ערימת ה-tiff המכילה את התאים ב- ImageJ, ולהשתמש בכלי הבחירה ביד חופשית כדי לצייר אזור מעניין על פני קרדיומיוציט פלואורסצנטי, בערוץ האדום, תוך טיפול כך שהאזור גדול מספיק כדי שהתא לא יזוז מהאזור תוך כדי התכווצות.

לאחר מכן, בחרו 'נתח', 'כלים', 'מנהל אזור העניין' ובחרו 'הוסף T', כדי להוסיף את האזור כאזור עניין 1. גרור את אזור העניין מעל אותו תא בערוץ הירוק והוסף אזור זה כאזור עניין 2. בתפריטים 'נתח' ו'קבע מידות', בטלו את הבחירה בכל האפשרויות פרט לערך האפור הממוצע.

במנהל אזורי העניין, לחצו על 'עוד' ו'מידה מרובה' לבחירת האפשרויות 'למדוד את כל הפרוסות' ו'שורה אחת לפרוסה' ולחצו על הלחצן 'אשר'. ייפתח חלון המכיל גיליון אלקטרוני עם שלוש השורות. השתמש ב'קובץ' ו'שמירה בשם' כדי לשמור את הגיליון האלקטרוני בקובץ ערך מופרד באמצעות פסיקים. סגור את החלון עם מחסנית התמונות וחלון הגיליון האלקטרוני מבלי לסגור את החלון Region of Interest Manager, ופתח את מחסנית ה- tiff המכילה את מדידת הרקע.

במנהל אזור העניין, לחצו על האפשרויות 'עוד' ו'מידה מרובה' לבחירת האפשרויות 'מדוד את כל הפרוסות' ו'שורה אחת לפרוסה' ולחצו על הלחצן 'אשר'. לאחר מכן שמור את נתוני הרקע בקובץ csv נפרד. כאן, נציג אחד IPS תא נגזר cardiomyocyte מתואר עם קווים מנוקדים לבנים המסמנים את אזורי העניין, שצוירו במהלך ניתוח ההדמיה בערוצי RFP ו- GFP מוצג. האות מערוץ RFP מדגים עלייה תקופתית בעוצמת הפלואורסצנט במהלך כל פוטנציאל פעולה עקב העברת אנרגיה כפויה או תהודה גוברת הנגרמת על ידי שינויים בפוטנציאל הממברנה.

באופן קונקורדנטי, אות GFP מציג ירידה תקופתית בעוצמת הפלואורסצנטיות. יחס RFP/GFP הוא האות הביולוגי המשמש בניתוחים במורד הזרם, כגון משך פעולה פוטנציאלי 50 ו -90 מדידות. לדוגמה, בשיטה זו, חדר בן 30 יום כמו קרדיומיוציטים שמקורם בתאי IPS שהונחו ב- 0.5 הרץ, הראה משך פוטנציאלי פעולה ממוצע של 50 מתוך 439 אלפיות שניה, ומשך פוטנציאלי פעולה ממוצע של 90 מתוך 520 אלפיות שניה.

גירוי חשמלי של הקרדיומיוציטים שמקורם בתאי IPS בשיעורי גירוי הולכים וגדלים כל חמש פעימות, הדגים קיצור הדרגתי של פוטנציאל הפעולה ככל ששיעור המכות עלה. יתר על כן, טיפול אגוניסט תאים נגזר IPS באופן ספונטני עם isoproternol, אגוניסט קולטן בטא adreno לא סלקטיבי, הוביל לעלייה מהירה בשיעור המכות, זה יכול להיות מוגבר עוד יותר עם מינונים הולכים וגדלים של אגוניסט. בעוד שיטה זו מספקת תפוקה מעולה בהשוואה למדידות אלקטרופיזיולוגיות קלאסיות, יש להיות מודעים למגבלותיה, כולל רזולוציה זמנית המוגבלת על ידי המאפיינים הקינטיים המהותיים של חיישן המתח הפלואורסצנטי.