הערכה של הגומלין בין החלבון המשלים C1q וחומצה Hyaluronic בקידום הדבקה תא
15 ביוני 2019
המרכיב המשלים C1q היא מולקולה pro-דלקתיות מתבטאת במידה רבה בסביבה מיקרוסביבתית שיכולה לקיים אינטראקציה עם מטריצה החילוץ. כאן, אנו מתארים שיטה כדי לבדוק כיצד C1q הקשורים חומצה יאלורונית השפעות התא הדבקה.
הליך מקיף להערכת יחסי הגומלין בין החלבון המשלים C1q לחומצה היאלורונית בקידום הידבקות בתאים. לאחרונהגדרנו כי המרכיב המשלים C1q מולקולה של המערכת החיסונית המולדת באה לידי ביטוי מאוד במיקרו-וירוס הגידול והשליה ומצליחה לקיים אינטראקציה עם רכיב המטריצה החוץ-תאית. במקרה זה, חומצה היאלורונית.
אנו מציעים שיטה לחקר הפונקציות הביולוגיות של חלבונים ברחבי הסביבה האקרונומית. על מנת לחקור את היכולת של מולקולות אלה לעצב את תכונות חלוקת התאים של גורמי מטריצה חוץ תאית. על מנת ללמוד כיצד אינטראקציה זו יכולה להיות מושגת על ידי התאים הקיימים ברקמת הסביבה, הגדרנו שיטה קלה זו שבה תאים בינאריים הנגזרים מרקמות אנושיות הורשו לדבוק C1q מאוגד מטריצה חוץ תאית, במקרה זה חומצה היאלורונית.
עבור הליך ציפוי הצעד הראשון הוא מחייב של חומצה היאלורונית במשקל מולקולרי גבוה ל 96 מיקרופלסטיק מצופה רקמות היטב. עבור ציפוי, חומצה היאלורונית מדוללת 0.1 חופרת פחמן חיץ PH 9.6 בריכוז של 15 מיקרוגרם למיליליטר. ובעדינות צינורות הוא requited כדי להשיג פתרון הומוגני.
100 מיקרוליטרים של הפתרון משמשים לציפוי בארות. לאחר מכן הצלחת מועברת בארבע מעלות צלזיוס במהלך הלילה. למחרת ואקום שאף את הבאר המטופלת.
לשטוף פעם אחת עם dPBS. הוסף C1q או BSA בארות המתאימות. C1q זמין כיום מסחרית בריכוז של מיליגרם אחד למיליליטר והוא מדולל בריכוז של 25 מיקרוגרם למיליליטר.
ו-dPBS המכיל 0.5%BSA ו-0.7 מילימול סידן ומגנזיום ו- cations חלוקה. BSA LPS חינם משמש בריכוז של 0.5% ותאריך PBF. צלחת מועברת לאחר מכן בארבע מעלות צלזיוס לילה.
אינטראקציות תלויות מינון C1q עם חומצה היאלורונית משותקת נקבעת על ידי אנזים מקושר אימונו SA. תאים המתייגים באמצעות DiI מהיר. מעקב lipophilic מהיר DiI משמש כדי לתייג את התאים של עניין. תאים המתווסכלים ב- dPBS משמשים בריכוז של מיליון תאים למיליליטר.
ה-DiI המהיר מדולל בין 1 ל-100 ישירות לתוך ההשעיה של התא. ההשעיה התא מעורבב באופן ידני ומועבר ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לאחר חמש דקות דגירה, מערבבים את ההשעיה התא ולחזור על פעולה זו פעמיים נוספות.
כדי להסיר את עודף של DiI מהיר, להוסיף 10 מיליליטר של dPBS. יש לסובב בעדינות למעלה ולמטה ולהפוך לצנטריפוגה במהירות של 250 גרם למשך שבע דקות. תן מחדש את גלולת התא במיליליטר אחד של מדיום אנדופילי אנושי ללא סרום בנוכחות 0.1%BSA.
הידבקות בתאים על חומצה היאלורונית C1q מטריסות. ואקום שאף את ה- dPBS מה בארות מצופות. להפיץ 100 microliters של השעיית תא שכותרתו ל בארות מצופה.
200 מיקרוליטרים של תאים מסומנים מתפרקים בצינור תליון שישמש ליצרן עקומה סטנדרטי. דגירה את הצלחת במשך 35 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. תוציא את הצלחת מהחמה.
שאפו בעדינות את התאים הלא מאוזנים. יש לשטוף פעם אחת עם dPBS המכיל 0.5%BSA ו-0.7 מילימול סידן ומגנזיום. Lys התאים חסידים על ידי הוספת 200 microliters של מאגר תמיסת.
במקביל להכין את העקומה הסטנדרטית על אחד עד שניים דילול טורי של התאים המסווים במאגר תזה. בצע את הקריאה של אות florescence ב אינסוף F 200 T-can מכשיר באמצעות 544 ננומטרים כמו אורך גל העירור ו 590 ננומטר כמו אורך גל פליטה. תוצאות מייצגות.
כפי שמוצג על ידי התוצאות הייצוגיות, ניכר כי הידבקות התא על חומצה היאלורונית מצא C1q כמו משופרת מאוד בהשוואה HA לבד או HA קשור BSA. אחוז התאים החסידיים בכל מטריצה מחושב על בסיס העקומה הסטנדרטית. מסקנות. בניסויים שלנו קודם כל הערכנו את היכולת של הרכיב המשלים C12 לקשור את המטריצה החוץ תאית במקרה זה חומצה היאלורונית באמצעות מתכת אריסאלית.
שנית ניתחנו את היכולת של תאים ראשוניים אנושיים מוכתמים בצבע פלואורסצנטי לרדוף אחר חומצה היאלורונית קשורה. המודל שהצענו במחקר זה הוא שיטה קלה יותר ומהירה יותר וחלופה למודל תלת מימדי של פיגומי מטריצה חוץ-תאיים להערכה על תגובה תאית זו לשילוב של גירויים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את האינטראקציה בין רכיב המשלים C1q לבין חומצה היאלורונית, תוך התמקדות באופן שבו אינטראקציה זו משפיעה על היצמדות תאים. C1q, מולקולה פרו-דלקתית, מבוטאת באופן משמעותי במיקרו-סביבות של גידולים ובשלייה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- אימונולוגיה
רקע
- C1q הוא חלק ממערכת החיסון המולדת.
- הוא מבוטא ברמות גבוהות במיקרו-סביבות רקמתיות ספציפיות.
- C1q מקיימת אינטראקציה עם רכיבים של המטריקס extracelluar.
- חומצה היאלורונית היא רכיב מרכזי במטריקס extracellular.
מטרת המחקר
- להערכת תפקידו של C1q בהיצמדות תאים.
- לבחינת האופן שבו C1q הקשור לחומצה היאלורונית משפיע על התנהגות התאים.
- לפיתוח שיטה לחקר אינטראקציות בין חלבונים בסביבה החוץ-תאית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- נעשה שימוש בתאים בינאריים שהופקו מרקמות אנושיות.
- התאים הושארו להיצמד ל-C1q הקשור לחומצה היאלורונית.
- נוסד פרוטוקול מקיף לצורך ההערכה.
- תפקודיהם הביולוגיים של חלבונים הוערכו בהקשר של המטריצה החוץ-תאית.
תוצאים עיקריים
- האינטראקציה בין C1q לחומצה היאלורונית מעודדת היצמדות תאים.
- תאים מגיבים לנוכחות של C1q במטריקס החוץ-תאי.
- שיטה זו מספקת תובנות לגבי תכונות של חלוקת תאים המושפעות מגורמים חוץ-תאיים.
- לממצאים עשויות להיות השלכות על הבנת תגובות חיסוניות בסביבות רקמה.
מסקנות
- C1q ממלא תפקיד משמעותי בהידבקות תאים באמצעות האינטראקציה שלו עם חומצה היאלורונית.
- ניתן ליישם את השיטה שפותחה כדי להעמיק את חקר האינטראקציות בין חלבונים.
- הבנת אינטראקציות אלו עשויה להרחיב את הידע על תפקודי מערכת החיסון ברקמות שונות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הבנת האופן שבו חלבון המשלים C1q מווסת רכיבים של המטריקס החוך-תאי, כגון חומצה היאלורונית, מספקת תובנה מכניסטית לגבי אינטראקציות בין הגידול לסטרומה המניעות התקדמות המתווכת על ידי היצמדות. בדיקה זו מאפשרת הפחתת סיכונים מוקדמת של מטרות המעורבות בעיצוב מחדש של המיקרו-סביבה, וזאת על ידי כימות האופן שבו אותות ממקור חיסוני משנים את התנהגות התאים התלויה במטריקס. השיטה תומכת בתיקוף מטרות בתחום האימוןו-אונקולוגיה על ידי קישור של אפקטורים של מערכת החיסון המולדת לשינויים תפקודיים במטריקס החוך-תאי הרלוונטיים ליכולת גרורתית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן כיצד קישור של C1q לחומצה היאלורונית משנה את תכונות המטריקס כדי להשפיע על היצמדות תאי גידול, ובכך תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות עבור מתווכי מיקרו-סביבה.
- ערך תפעולי: מאפשר בדיקת השערות לגבי עיצוב מחדש של המטריקס המונע על ידי המשלים בפורמט מבוקר וניתן לשחזור, תוך שימוש בתאים ראשוניים המופקים מגידולים אנושיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: יוצר קריאות כמותיות מבוססות פלואורסצנציה של היצמדות תאים למטריצות C1q-HA, מה שמאפשר ניתוח תגובה-מנה של אינטראקציות בין חלבון למטריצה.
- ערך תפעולי: משתמש בפרוטוקול ציפוי סטנדרטי של 96 בארות עם ריכוזים מוגדרים של HA (15 µg/mL) ו-C1q (25 µg/mL) כדי להבטיח שחזור של הבדיקה לאורך מסעות סריקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מדגים כיצד C1q המבוטא בגידול מעצב מחדש היצמדות המתווכת על ידי HA, ובכך מציע מערכת רלוונטית למחלה לבחינת הפעלת הסטרומה בנאופלזיה.
- ערך תפעולי: מגשר בין שלב הגילוי לעבודה הפרה-קלינית על ידי אספקת שיטה ניתנת להרחבה להערכת התערבויות המכוונות למטריקס, תוך שימוש בתאי אדם רלוונטיים מבחינה קלינית.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל ממעורבות המטרה (target engagement) ועד לסריקה פנוטיפית, כאשר היצמדות תלוית-מטריצה משמשת כמדד תפקודי לוויסות של מסלולים בסביבה המיקרוסקופית של הגידול.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בהסרת סיכונים מנגנוניים על ידי בדיקה האם האינטראקציה בין C1q ל-HA מניעה פנוטיפים פרו-אדהזיביים בתאי גידול אנושיים ראשוניים.
- סריקה: מספק תוצאי אדהזיה כמותיים וסטנדרטיים התואמים להערכה בקיבולת בינונית של מודולטורים של קישור חלבון-מטריקס.
- אנליטיקה: כימות אות פלואורסצנציה באמצעות עקומה סטנדרטית מאפשר השוואה מדויקת של תנאי אדהזיה בין מטריצות של HA, C1q-HA ו-BSA-HA.
- מחקר תרגומי: משתמש בתאים המופקים מגידולים אנושיים ובמרכיבי מטריקס רלוונטיים פיזיולוגית כדי להגביר את הביטחון התרגומי באסטרטגיות למיקוד בסביבה המיקרו-סביבתית.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתן להתאים את הפלטפורמה לחקר חלבונים אחרים של המטריקס החוץ-תאי ומתווכי חיסון מעבר ל-C1q ו-HA, ובכך לתמוך בסטנדרטיזציה בין פרויקטים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בתקשורת בין הגידול לסטרומה על ידי בידוד השפעתו של C1q על היצמדות תלוית HA.
- ערך תפעולי: שלבי ציפוי וחסימה מוגדרים (למשל, דגירה למשך לילה ב-4°C, שטיפות ב-dPBS) מקדמים סטנדרטיזציה של הבדיקה ויכולת שחזור בין מעבדות.
- ערך אסטרטגי: מספק מידע לקבלת החלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) באמצעות כימות האופן שבו אינטראקציות בין המטריקס למערכת החיסון משפיעות על התנהגויות תומורגניות מוקדמות, כגון צמיחה תלוית-עיגון.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות המעורבות בתקשורת בין המשלים למטריקס על בסיס תוצאי היצמדות פונקציונליים, תוך התאמה לסיכון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בציפוי חלבונים, תרביות תאים וטכניקות כימות מבוססות פלואורסצנציה.
- תלוי בגישה לקוראי מיקרו-פלטות פלואורסצנטיים המסוגלים לבצע עירור ב-544 nm ופליטה ב-590 nm לצורך זיהוי fast DiI.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי סימון תאים (למשל, דילול fast DiI, זמני אינקובציה) כדי להבטיח אות עקבי בין ניסויים.
- התאמה לחלבוני מטריקס אחרים עשויה לדרוש אופטימיזציה של באפרי ציפוי ותנאי אינקובציה כדי לשמור על תפקוד החלבון.
- המגבלות כוללות הסתמכות על מודלים של היצמדות בדו-ממד (2D), אשר עשויים שלא לשקף באופן מלא את המורכבות הסטרומלית התלת-ממדית הנצפית in vivo.
