בידוד של אחת הקהילות חיידקי תאיים שנוצר ממודל מאתר של זיהום בדרכי השתן לניתוח תא בודד במורד הזרם

קהילות חיידקים תאיים, או IBCs, נצפו בעכברים שקיבלו זיהומים ניסיוניים בדרכי השתן, או UTIs. הם גם נראו במשיעי השתן של חולי UTI אנושיים. הטכניקה שאנו מתארים היום היא דרך לבודד IPCs יחיד מעכברים נגועים בניסויים.

טכניקת micropipetting הפה היא הטכניקה היחידה הזמינה כיום עבור בידוד חיידקים תאיים משלפוחיות עכבר נגועות. כדי להכין פיפיות פה זכוכית, לצבוט בחוזקה את שני הקצוות של צינור נימי זכוכית באופן שווה לסובב את אמצע הצינור קדימה ואחורה לאורך הציר שלה על מקור להבה פתוח. כאשר הזכוכית הופכת רכה, להסיר את נימי ממקור החום ומיד למשוך את הזכוכית לגזרים.

האורך הסופי האידיאלי של נימי משך הוא שלושה עד חמישה סנטימטרים יותר נימי unpulled כדי להבטיח קוטר פנימי מתאים לבודד תאים אפיתל שלפוחית השתן יחיד. כאשר הזכוכית התקררה, בדוק אם אמצע נימי הזכוכית צר יותר ושפנים הצינור עדיין חלול. להרים את הקצה הגדול של נימי משך ביד אחת, להשתמש מדפים כדי לתפוס את נימי בנקודה הצרה ביותר שלה, לוודא המדפים מופעלים עם מספיק כוח כדי לאחוז נימי בחוזקה מבלי למחוץ אותו.

סובב במהירות את המדפים כדי לצלם את נימי המשכה בנקודה הצרה ביותר. לאחר מכן, מניחים את נימי בגודל מיקרופיפט בפה בצלחת פטרי 100 מילימטר ו UV לעקר את המנה במשך 30 דקות. כדי לקצור את שלפוחית השתן, מניחים עכבר בתצורת supine ולעקר את אזור הבטן עם 70% אתנול.

באמצעות ממטרים מעוקרים אתנול ומספריים כירורגיים, לבצע חתך עור רוחבי בסנטימטר אחד מעל פתח השופכה ולהרחיב את החתך באלכסון לכיוון הגפיים העליונות של העכבר כדי ליצור חתך בצורת V לאורך כל החלק הראשון של העכבר החושף את התוכן של peritoneum. באמצעות כלים מעוקרים חדשים, בעדינות לדחוף למטה על רפידות השומן ליד אזור האגן של העכבר כדי לגרום לשלפוחית השתן לבוט ולתפוס את שלפוחית השתן החשופה על שיא. שמירה על אחיזה איתנה על שלפוחית השתן, לחתוך את השופכים ואת השופכה כדי לשחרר את שלפוחית השתן ולהכניס את הקצה של פיר אחד של מדפים מעוגל לתוך פתיחת שלפוחית השתן שבו זה היה רק חרות.

שחררו את המלכודות שאוחזות את העופרת ושומרות על המדפים מעוגל סגורים כמעט לחלוטין, השתמשו בזוג מלכודות שני כדי למשוך בעדינות את הקצה החיצוני של הפה של שלפוחית השתן הרחק מהמדפים העגולים ומסובבים את הקצה השני של המדפים המגולפים כדי להפוך את שלפוחית השתן מבפנים החוצה. לאחר מכן, השתמש בזוג המדפים השני כדי לפתות בעדינות את שלפוחית השתן ההפויה מקצות הממטרים למיליליטר אחד של PBS קר. ובעדינות לגרד את שכבת התא האפיתל הפנימי בצד החיצוני של שלפוחית השתן הפוכה עם שני זוגות של מדפים נקיים.

כאשר כל התאים כבר גירד, להכניס את הקצה unpulled של נימי זכוכית משך לתוך תקע הגומי של צינור שאפתן להתאים בחוזקה את הקצה הצר של קצה פיפטה מיליליטר אחד לתוך הקצה הפתוח השני של הצינור. התאימו היטב את הקצה הצר של פיפטה שאפתנית של שני מיליליטר לקצה הפתוח והרחב יותר של קצה החלילן המיליליטרי והמקום את מתלי התאים השרוטים תחת מיקרוסקופ ניתוח. באמצעות הגדלה של פי 20 עד 40, זהה את ה- IBCs כאגרגטים פלואורסצנטיים גדולים וטבול את הקצה המשובח של נימי הזכוכית בצינור טרי של PBS לשנייה אחת כדי להפחית את ספיגת נפח לא רצוי באמצעות פעולה נימית.

כאשר IBC של עניין כבר ממוקם, לאט להביא את הקצה הפתוח של הצינור נימי לכיוון IBC ולהחיל כוח יניקה קטן מאוד על פיפטה שאפתן להנחות את IBC לתוך נימי הזכוכית. לאחר מכן, להעביר את נימי ריק 1.5 צינור צנטריפוגה מיליליטר ולהחיל לחץ חיובי קל לגרש את טיפה IBC לתוך הצינור. בנוסף לאישור נוכחותו של IBC מבודד אחד בצינור האיסוף באמצעות המיקרוסקופ המ לנתח, טוהר IBC המבודד יכול להיות מאושר על ידי מיקרוסקופ קונפוקלים.

התאים המבודדים צריכים להכתים הן E.coli והן uroplakin צריך להיות בין 50 ל 120 מיקרומטר בגודל. לאחר הבידוד, ניתן לאשר את נוכחותם וכדאיותם של תאי החיידקים ב- IBC הבודד באמצעות כימות יחידה יוצרת מושבה או תגובת שרשרת פולימראז כמותית למקבילות גנומיות. יש לציין, תאי אפיתל לא מושפעים מבודדים עם אותו פרוטוקול אינם מדגימים כמויות לכימות של חיידקים.

יתר על כן, ניתוח תגובת שרשרת פולימראז שעתוק הפוך כמותי מאשר את נוכחותם של גנים חיידקיים במגוון של IBCs מבודדים ומגובים בנפרד. תמיד לוודא כי micropipette הפה יכול להרים ולגרש נוזל בקלות. אל תהססו לשנות את נימי או את המנגנון כולו אם micropipette הפה מרגיש occluded.

טכניקת מיקרופיטינג בפה זו מאפשרת לנו לחקור באופן ישיר ומפורש את האוכלוסיות תאיות הטופס במהלך UTI ניסיוני. ללא טכניקה זו, אוכלוסיות תאיים אלה יהיו מזוהמים בחיידקים חוץ-תאיים ונחיתות במספרם. כמה סוכנים זיהומיות אחרים עשויים להיות בקלות רבה יותר aerosolized או מועבר מאשר E.coli השתמשנו ביישום זה.

במקרים אלה, פקדים נוספים מסוימים עשויים אפוא להיות מוצדקים, כגון הוספת מסנן או הארכת הצינור, בהתאם ליישום בו נעשה שימוש. IBCs מבודדים באמצעות טכניקת micropipetting הפה זה עשוי לשמש בניתוחים אחרים במורד הזרם תא יחיד, כגון QRTPCR או רצף RNA.