מדידות סימולטני של סידן תאיים, פוטנציאל ממברנה אנדותל מוחי העכבר טרי מבודדת ללא פגע
20 בינואר 2019
המודגמות כאן הם פרוטוקולים לבידוד (1) טרי שלם מוחי אנדותל "צינורות" ומדידות (2) בו זמנית הסידן אנדותל של קרומית אפשרית במהלך אנדותל, נגזר hyperpolarization. עוד, שיטות אלה מאפשרים כוונון תרופתי של תאי אנדותל סידן, איתות חשמלי כמשתנים ניסיוני בודדים או אינטראקטיביות.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפיזיולוגיה של כלי הדם המוחיים בכל הנוגע לוויסות זרימת הדם המוחי במהלך ההזדקנות וההתפתחות של מחלות כרוניות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת מדידה בו זמנית של סידן תאי ופוטנציאל קרום של אנדותל עורקי מוחי בצורתו המקורית בתנאים פיזיולוגיים. כדי לבודד את מוח העכבר, מתחת למיקרוסקופ להסיר את העור והשיער מעל הגולגולת.
ולהסיר דם מוגזם עם PSS ללא סידן קר. לאחר מכן, בצע חתך באמצעות רק את קצות מספריים ניתוח סטנדרטי. החל מעצם העורף ונרחב דרך עצם האף של הגולגולת.
ואז לפתוח את הגולגולת בזהירות לאורך החתך, באמצעות מדפים גסים ולהפריד את רקמת החיבור כדי לחשוף את המוח. לשטוף בעדינות את המוח המבודד עם PSS ללא סידן קר במקו כדי להסיר את הדם. מניחים את הצד הגחוני במוח בתא המכיל פתרון ניתוח קר לבידוד של עורקים מוחיים.
כדי לבודד את העורקים המוחיים, לאבטח את המוח המבודד בתתבר ניתוח קר על ידי החדרת שני סיכות נירוסטה דרכו, לתוך ציפוי פולימר סיליקון חדורים בפחם בתחתית צלחת פטרי זכוכית. לאחר מכן, לבודד בניתוח את העורקים המוחיים האחוריים על 0.3 כדי 0.5 ס"מ קטעים מן העורקים האחוריים תקשורת בזילאר. השתמש סיכות נירוסטה כדי לאבטח את שני העורקים המוחיים האחוריים מבודדים בתת פתרון הניתוח בצלחת פטרי.
לאחר מכן נקו את העורקים המוחיים האחוריים המבודדים בזהירות על ידי הסרת רקמת חיבור באמצעות מדפים מחודדים בעלי קצה דק. חותכים את העורקים שלמים למקטע אחד עד שני מילימטרים לעיכול אנזימטי. בהליך זה, הכינו את מנגנון הטריטורציה באמצעות מיקרוסקופ, מצלמה ושלב אלומיניום המחזיק תא ומיקרומניפולטורים.
אבטחו מיקרו-רינג עם בקר משאבה צמוד לבמה ולדגימה. לאחר מכן מלאו מחדש פיפטה עם שמן מינרלי ואבטחו אותה מעל בוכנה מיקרו-סירינג. לאחר מכן באמצעות microsyringe עם בקר המשאבה למשוך כ 130 nanoliters של פתרון דיסוציאציה לתוך פיפטה תוך הבטחת היעדר בועות אוויר.
לאחר מכן, מניחים מקטעי עורקים שלמים לתוך מיליליטר אחד של פתרון דיסוציאציה עם ריכוזים נדרשים של אנזימים בצינור זכוכית 10 מיליליטר. דגירה ב 34 מעלות צלזיוס במשך 10 עד 12 דקות לעיכול חלקי. לאחר העיכול, החלף את פתרון האנזים בחמישה מיליליטר של פתרון דיסוציאציה טרי.
באמצעות פיפיאט מיליליטר אחד, להעביר קטע אחד לתוך התא המכיל פתרון דיסוציאציה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן מניחים את הפיפסה בתת פתרון הדיסוציאציה בתא וממקם אותה קרוב לקצה אחד של הכלי המתעכל. הגדר קצב בטווח של שניים עד חמישה nanoliters לשנייה על בקר המשאבה עבור טריטורציה עדינה.
תוך כדי צפייה דרך 100 פעמים עד 200 פעמים הגדלה לסגת ולפלט את קטע העורקים כדי לנטרל תאי שריר חלקים תוך הפקת צינור אנדותל. במידת הצורך, השתמשו בזהירות במקלות עדינות כדי להפריד בין הרפתקנות ניתוקת לבין למינה אלסטית פנימית מהצינור ה אנדותל. אשר כי כל תאי השריר החלקים נותק, כי רק תאים אנדותל להישאר כמו צינור שלם.
באמצעות מיקרומניפולטורים, לאבטח כל קצה של הצינור אנדותל על החלקת כיסוי הזכוכית של תא עירוי באמצעות פיפטים הצמדת זכוכית borosilicate. לשטוף את ההרפתקה ניתוק ותאי שריר חלקים מהתא. ולהחליף את פתרון דיסוציאציה עם שני טוחנות יותר סידן כלורי PSS.
העבר את הפלטפורמה הניידת עם צינור אנדותל מאובטח למיקרוסקופ של סופרפוזיה ומתקן ניסיוני. לאחר מכן השתמש שישה מאגרים נקיים 50 מיליליטר עבור אספקה רציפה של PSS ופתרונות סמים בהתאמה במהלך הניסוי. השתמש שסתום בקרת זרימה בשורה כדי להגדיר באופן ידני את קצב הזרימה עקבי כמו זרימת למינר תוך התאמת הזנת זרימה יניקה ואקום.
ספק PSS לתא עבור עירוי העל של הצינור ה אנדותל לפחות חמש דקות לפני הקלטת נתוני הרקע וטעינת צבע. כדי למדוד את פוטנציאל הממברנה בו זמנית עם ריכוז סידן תאי, משוך אלקטרודה חדה ומילוי אחורי שלה עם שני אשלגן כלורי טוחן כדי להקליט מתאים עמוסים צבע fura-2. כדי לחקור את הצימוד תאי באמצעות העברת צבע, backfill את microelectrode עם 0.1% פרופידיום יודיד מומס בשני אשלגן כלורי טוחן.
במקום הבא האלקטרודה מעל חוט כסף מצופה כלוריד במחזיק פיפטה מחובר לשלב ראש אלקטרומטר מאובטח עם מיקרומניפולטור. השתמש micromanipulator כדי למקם בקצרה את קצה האלקטרודה לתוך PSS זורם בתא, תוך צפייה דרך המטרה ארבע פעמים. לאחר מכן, להגדיר את פוטנציאל קרום מנוחה לאפס עולה בקנה אחד עם פוטנציאל אמבטיה מקורקע.
אם תרצה, השתמש בצגים בסיסיים נשמעים המקושרים לאלקטרומטרים כדי לשייך צליל עם הקלטות פוטנציאליות. לאחר מכן, להגדיל את ההגדלה ל 400 פעמים באמצעות מטרה 40 פעמים ולמקם את קצה האלקטרודה רק מעל התא של הצינור אנדותל. התאם את החלון הפוטומטרי באמצעות תוכנת הפוטומטריה כדי להתמקד בכ- 50 עד 80 תאים אנדותל.
ואז בעדינות למקם את האלקטרודה לתוך אחד התאים של הצינור אנדותל באמצעות micromanipulator ולחכות לפחות שתי דקות עבור פוטנציאל קרום מנוחה להתייצב. לאחר מנוחת פוטנציאל הממברנה יציבה בערך הצפוי שלה, להפעיל את הצינור photomultiplier על ממשק פלואורסצנטי בהיעדר אור ולהתחיל רכישת ריכוז סידן תאיים על ידי מרגש Fura-2 לסירוגין ב 340 ו 380 ננומטר תוך איסוף פליטת פלורציה ב 510 ננומטר. לאחר מדידות בו זמנית של פוטנציאל קרום וריכוז סידן תאיים הוקמו, לאפשר כחמש דקות עבור עירוי העל של צינור אנדותל עם PSS בקצב זרימה למינארית קבוע לפני היישום של תרופות.
החל את התרופה מוכנה PSS לתא עירוי על בקצב זרימה קבוע. במהלך הטיפול התרופתי למדוד את פוטנציאל הממברנה ביחסי F340/F380 בו זמנית. ברגע שהניסוי נעשה, למשוך את האלקטרודה מהתא.
ואז להפסיק הקלטות בהתאמה של פוטנציאל קרום ריכוז סידן תאי ולשמור את הקבצים לניתוח נתונים. זוהי תמונת ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית של צינור אנדותל עורקי מוחי של העכבר, מותאם לניסוי בחלון פוטומטרי באמצעות מטרה 40 פעמים. אלקטרודה חדה ממוקמת בתא, כפי שמוצג בחלק העליון של התמונה.
להלן הדוגמאות של עקבות גולמיים למדידה בו זמנית של יחס F340/F380 ופוטנציאל קרום בתגובה ל- ATP של 100 מיקרומולרים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקאלית, על מנת לענות על שאלות נוספות לגבי איתות מיקרו-דומיין של סידן אנדותל, ו מיני חמצן תגובתי, כדוגמאות. באופן כללי טכניקה זו תמשיך לסלול את הדרך למחקרים בפיזיולוגיה התאית כדי לחקור את תפקוד כלי הדם והזדקנות במחזור הדם והלימפה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מפרט פרוטוקולים לבידוד צינוריות אנדותל מוחיות שלמות ולמדידת פוטנציאל הממברנה ורמות הסידן באנדותל במהלך היפר-פולריזציה מושגית-אנדותל (endothelium-derived hyperpolarization). היכולת להשפיע באופן פרמקולוגי על סיגנלים חשמליים ועל הסידן מספקת תובנות לגבי פיזיולוגיה של כלי הדם במוח, ובמיוחד בהקשר של ויסות זרימת הדם המוחית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- פיזיולוגיה של כלי הדם במוח
- בקרה של זרימת דם מוחית
- סיגנלינג של תאי אנדותל
רקע
- מחקר זה מתמקד בגומלין שבין איתות סידן אנדותליאלי לבין פוטנציאל ממבנה.
- הבנת מנגנונים אלו חיונית לטיפול בבעיות הקשורות להזדקנות ומחלות כרוניות.
- השיטות שפותחו מאפשרות תצפית בתנאים פיזיולוגיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד עורקים מוחיים והכנת צינורות אנדותל
- מודל עכבר לניסויים in vivo
- מדידה סימולטנית של סידן תוך-תאי ופוטנציאל ממברנה
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של צינורות אנדותליאליים תוך שמירה על תפקודם.
- יכולת לניטור של אותות תוך-תאיים תחת תנאים פיזיולוגיים.
- תובנות לגבי תגובות אנדותליאליות לחומרים פרמקולוגיים.
מסקנות
- מחקר זה מדגים טכניקה חדשנית לבחינת התפקוד האנדותליאלי בעורקים המוחיים.
- הממצאים תורמים להבנה מעמיקה יותר של הגורמים המשפיעים על זרימת הדם המוחית, הרלוונטיים לתהליכי הזדקנות ומחלה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת מדידה סימולטנית של סידן תוך-תאי ופוטנציאל ממברנה באנדותל מוחי שלם תחת תנאים פיזיולוגיים, ובכך מספקת קריאה ישירה של איתות היפר-פולריזציה ממקור אנדותלי (EDH). על ידי לכידה של צימוד בזמן אמת בין זרמי Ca2+ לבין ויסות טונוס בכלי דם, היא תומכת בהסרה מכניסטית של סיכונים במטרות המעורבות בבקרת זרימת דם מוחית. גישה זו מציעה ערך ניבוי להערכת תפקוד לקוי של האנדותל במודלים של מחלות נוירודגנרטיביות ומחלות בכלי הדם המוחיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן את הקשר התפקודי בין שחרור Ca2+ תוך-תאי לבין הפעלת תעלות K+ במסלולי העברה של תאי אנדותל.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף של מודולטורים פרמקולוגיים של תעלות SKCa/IKCa בהקשר של רקמה טבעית.
- ערך מדעי: תומך בבדיקת היפותזה לגבי מרכיבי EDH כמתווכים של התרחבות כלי דם באופן שאינו תלוי בחנקת תחמוצות (nitric oxide).
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר קריאות כמותיות ורציומטריות של Fura-2 Ca2+ ומדידות Vm באמצעות אלקטרודה חדה לצורך אפיוס תגובה למינון.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של הכנת תאי אנדותליום באמצעות עיכול אנזימטי וטריטורציה (trituration) להשגת צינורות אנדותליאליים ניתנים לשחזור.
- ערך מדעי: מודד את ההתפשטות המרחבית של EDH דרך צמתי פער (gap junctions) למרחקים של עד מילימטרים, דבר המעניק מידע לבדיקות איתות ברמת הרשת.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקשר בין הדינמיקה של Ca2+ ו-Vm אנדותליאליים לבין ויסות זרימת הדם המוחית במצב בריאות ובמחלה.
- ערך תפעולי: שומר על שלמות ותפקוד האנדותל תחת סופרפוזיה פיזיולוגית (pH 7.4, 37°C) להקלטות ממושכות.
- ערך מדעי: מאפשר הערכה פרה-קלינית של תגובתיות כלי דם במודלים של עכברים להזדקנות ומחלות כרוניות.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לאפיון פנוטיפי פרה-קליני, ומספקת קריאה תפקודית של סיגנל endothelium המגשרת בין מנגנונים מולקולריים לתוצאות פיזיולוגיות.
- ביולוגיה של הגילוי: בודק השערות בנוגע לתרומתם של תעלות K+ המופעלות על ידי Ca2+ ל-EDH ולטון וסקולרי.
- סריקה: מספק קריאות בו-זמניות ובזמן אמת של שטף יונים ופוטנציאל חשמלי לצורך פרופיל של השפעת תרכובות באנדותל טבעי.
- אנליזה: מספק את יחס F340/F380 ומסלולי פוטנציאל ממברנה כנקודות קצה מתואמות לניתוח מסלולים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין איתות תאי לבין התרחבות כלי דם ברמת הרקמה, מה שתומך בהסברה לוויסות זרימת דם in vivo.
- שימוש חוזר ארגוני: מכונן פלטפורמה לשימוש חוזר לסריקה תפקודית של אנדותל במגוון מיטות כלי דם ומודלים של מחלות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית ב-EDH על ידי קישור ישיר של פעימות Ca2+ לאירועי היפר-פולריזציה.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזוריות באמצעות בידוד וסופרפוזיה סטנדרטיים תחת תנאים פיזיולוגיים מבוקרים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי אישור מעורבות המטרה במערכת אנדותל רלוונטית פיזיולוגית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של תרכובות המכוונות לתעלות יונים אנדותליאליות על בסיס תיקוף תפקודי.
שיקולי יישום
- מומחיות במיקרו-דיסקציה (microdissection), הכנה אנזימטית של רקמות והקלטה אלקטרופיזיולוגית.
- מכשור למדידת פוטנציאל חשמלי באמצעות אלקטרודות חדות, זיהוי פלואורסצנציה מבוסס פוטומולטיפליקטור (photomultiplier) וסופרפוזיה (superfusion) מיקרופלואידית.
- סטנדרטיזציה של הכנת צינורות אנדותליאליים והרכבתם בין מפעילים ומעבדות שונות.
- שיקולי התאמה עבור צינורות אנדותליאליים ממיטות כלי דם או ממינים שונים.
- מגבלות כוללות מורכבות טכנית של הקמה סימולטנית של אלקטרודות חדות ופוטומטריה, ודרישה לבידוד רקמה טרייה.
