שיטת החלוקה של מיקרו-אלקטרודה להקלטת פוטנציאל ממברנה מעורק מוחי אמצעי של קאננולוב
2 ביולי 2019
המטרה העיקרית של מאמר זה היא לספק פרטים כיצד להקליט פוטנציאל ממברנה (Vm) מעורק המוח האמצעי באמצעות שיטת החלוקה של המיקרואלקטרודה. העורק האמצעי של המוח הבינוני הוא בינוני כדי לצבור טון מיוגני, והקיר כלי מופד באמצעות מיקרואלקטרודות עמידות גבוהה.
פרוטוקול זה יכול לשמש כדי למדוד את פוטנציאל הממברנה של כלי דם נורמליים וחלליים כדי להעריך סוכנים תרופתיים לווסת את פוטנציאל הממברנה, הטון כלי הדם, וזרימת הדם. פוטנציאל הממברנה שנוצר מטכניקה זו קרוב לטווח הפיזיולוגי שכן השרירים החלקים בכלי הדם בתוך כלי נמצאים בסנכרון. לפני תחילת ההליך, מניחים מגבר אלקטרומטר דיפרנציאלי דו-ערוצי קרוב לתא כלי השיט במיקום הרצוי.
השתמש בכבל BNC-BNC כדי לחבר את הפלט של ערוץ המגבר A או B לקלט הערוץ של הדיגיטייזר. הר את הגשוש במיקרומניפולטור, וסובב את המיקרומניפולטור לכיוון המיקרוסקופ והמיוגרף על שולחן ללא רטט. מניחים את הידיות והמתגים בחזית המגבר במיקומים המתאימים לניסוי, כמתואר במדריך.
לאחר מכן חבר את קרקע האמבטיה לקרקע המעגלית של המגבר עם אלקטרודה מתאימה, וודא שהכלוב מקורקע למארז המגבר. כדי להכין את microelectrodes זכוכית borosilicate, להשתמש מושך סטנדרטי כדי להשיג קצר, הדרגתי, שמונה עד 10 מילימטר להתחדד עם קוטר פחות ממיקרומטר אחד, לולאה פעמיים עבור התנגדויות גבוהות יותר וטיפים קטנים יותר. השתמש מזרק מיקרופייבר כדי למלא את microelectrode עם שלושה טוחנות אשלגן כלורי, לאט לסגת הבוכנה במהלך ההזרקה כדי לאפשר מקום לנוזל למלא ולמנוע היווצרות של בועות בתוך microelectrode.
מניחים את המיקרו-אלקטרוד הטעון במלואו על מחזיק המיקרו-אלקטרורוד, ודחפו בזהירות אך בחוזקה את שוק האלקטרודה לתוך המחזיק דרך החור המשועמם. הסר כל נוזל עודף עם רקמת מעבדה, וחבר את מכלול מחזיק האלקטרודה לבדיקה המגבר. לבצע בדיקת אלקטרודה כדי למדוד את עמידות האלקטרודה.
לאחר מכן פתח את תוכנת ההקלטה, הקצה שם לקובץ ושמור את הקובץ לניתוח עתידי. לאחר מכן, לשטוף את תא מיוגרף עם מים מזוקקים מספר פעמים לפני טעינת התא עם חמישה מיליליטר של תמיסת מלח פיזיולוגית נורמלית, או PSS. באמצעות מזרק 5 או 10 מיליליטר, למלא הן קנולה זכוכית צינורות המצורפת עם PSS נורמלי מסונן מבלי להציג את כל בועות אוויר, ולהשתמש מטסים קהה לעשות חצי קשר בשני תפרים ניילון monofilament 10-0.
לאחר מכן, באמצעות מעצורי ניתוח תחת מיקרוסקופ ניתוח, מניחים את קשרי התפר הסגורים חלקית על שתי הנולאס מעט הרחק מהטיפים. לבידוד עורק מוחי באמצע, השתמש במספריים ומדפים באביב כדי לזהות ול לנתח קטע לא משופץ של עורק המוח האמצעי, בקוטר פנימי של 100 עד 200 מיקרומטר, של מוח החולדה. השתמש מדפים עדין כדי לעלות על העורק המוחי האמצעי על cannulas זכוכית, ולהדק את התפרים כדי לאבטח את העורק אל cannula.
סגור את צינורית דיסטל כך שלא תהיה זרימה בתוך העורק, ולחבר את פיפטה הזרימה למאגר של PSS. דמיינו את עורק המוח האמצעי המעוות באמצעות מצלמת התקן מרוכב בטעינה המותקנת על מיקרוסקופ הפוך ותופת הדמיה. הגדר את האורך האקסיאלי של MCA לאורך משוער כך שהוא לא נראה נוקשה ולא רפוי.
לצייד את פתרון האמבטיה עם 95%חמצן ו 5% פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס. לטבול את הקרקע של המגבר ב PSS של ההייאוגרף. להאיר את תא כלי הקיבול, ולדמיין את קצה microelectrode בת פתרון האמבטיה דרך המיקרוסקופ.
באמצעות micromanipulator, להזיז את קצה microelectrode קרוב לקיר החיצוני של כלי הדם, ולהתחיל את ההקלטה. להזיז לאט את קצה microelectrode לכיוון כלי השיט, מכוון למרכז הספינה. כאשר הקצה מגיע בסמיכות לכלי השיט, לקדם את האלקטרודה קדימה בתנועה מהירה אחת כדי לשפד את קרום השריר.
לאחר חדירת הממברנה, ניתן לראות שינויים בפוטנציאל הממברנה. אל תיגע במיקרומניפולטור ברגע שהמברנה תשולף. לאחר שהשינויים הפוטנציאליים בממברנה נרשמו, השתמש בתפעלן כדי להסיר את המיקרו-אלקטרונירוד בתנועה מהירה אחת, והפסק את ההקלטה לפני שמירת קבצי הנתונים.
אימפלמנט נחשב מוצלח כאשר יש הסטה מהירה לערכים שליליים, פוטנציאל הממברנה יציב למשך 30 שניות לפחות, והמתח חוזר בפתאומיות לאפס מילי-וולט עם הסרת האלקטרודה. לאחר שידול מוצלח וייצוב פוטנציאלי קרום, תרופות מעניינות ניתן לחדור לתוך האמבטיה ושינויים בפוטנציאל הממברנה ניתן לתעד. בניסוי מייצג זה, תרכובת עם אשלגן כלורי depolarized את הממברנה על ידי כשישה מיליוולטים, בעוד תרכובת עם מפעיל תלוי סידן של מוליכות גדולה מופעל אשלגן ערוצי אשלגן היפרפולרתי את הממברנה על ידי כמעט ארבעה מילי-וולט.
הדבר החשוב ביותר שיש לזכור הוא למשוך מיקרואלקטרוניקרודים עמידים מאוד שיש להם קצר, הדרגתי להתחדד עם קוטר פחות ממיקרומטר אחד.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מפרט פרוטוקול להקלטת פוטנציאל ממברנה (V m) מהעורק המוחי האמצעי באמצעות שיטת דקירת מיקרו-אלקטרודה. טכניקה זו מאפשרת מדידה של פוטנציאלים של ממברנה הן בכלי דם תקינים והן בכלי דם חולים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- אלקטרופיזיולוגיה
- ביולוגיה של כלי הדם
- פרמקולוגיה
רקע
- העורק המוחי האמצעי חיוני לזרימת הדם המוחית.
- הבנת פוטנציאל הממברנה חיונית להערכת טונוס כלי הדם.
- שיטה זו יכולה להעריך סוכנים פרמקולוגיים המשפיעים על זרימת הדם.
- פוטנציאלי הממברנה קרובים לטווחים פיזיולוגיים בשל הסינציטיום של השריר החלק בכלי הדם.
מטרת המחקר
- לספק פרוטוקול מפורט למדידת פוטנציאל ממברנה.
- להעריך את השפעתם של סוכנים פרמקולוגיים על טונוס כלי הדם.
- להעמיק את ההבנה של ויסות זרימת הדם במצב בריאות ובמחלה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש במגבר אלקטרומטר דיפרנציאלי בעל שני ערוצים.
- חיבור המגבר לממיר דיגיטלי (digitizer) באמצעות כבל BNC-BNC.
- הצבת הגשושית במיקרו-מניפולטור לצורך מיקום מדויק.
- כיוון הגדרות המגבר בהתאם למדריך הניסוי.
תוצאות עיקריות
- מדידה מוצלחת של פוטנציאל ממבנה בעורק המוח האמצעי.
- הדגמה של ישימות הטכניקה הן לכלי דם תקינים והן לכלי דם חולים.
- תיקוף של הרלוונטיות הפיזיולוגית של פוטנציאלי ממבנה שנמדדו.
- תובנות לגבי ויסות טונוס כלי דם על ידי סוכנים פרמקולוגיים.
מסקנות
- שיטת השחיתה של מיקרו-אלקטרודה יעילה לחקר פיזיולוגיה של כלי דם.
- פרוטוקול זה יכול לסייע בהערכה של חומרים טיפוליים המכוונים למצבים וסקולריים.
- מחקרים נוספים יכולים להרחיב את ההשלכות של פוטנציאל ממברנה על בריאות כלי הדם.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מדידה מדויקת של פוטנציאל הממברנה של שריר חלק בכלי דם מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית עבור מודולטורים של תעלות יונים בתוכניות פרה-קליניות קרדיווסקולריות וצֶרֶבּרוֹוַסְקולריות. שיטה זו תומכת בתיקוף המטרה על ידי קישור תוצאות אלקטרופיזיולוגיות לוויסות טונוס כלי דם וזרימת דם, ובכך מספקת ביטחון ניבוי לאופטימיזציה של תרופות מובילות. היא מגשרת בין ביולוגיה של גילוי להערכה טרנסלציונלית של סוכנים פרמקולוגיים המשפיעים על פרפוזיה מוחית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן השערות טיפוליות על תפקוד תעלות יונים ומשאבות אלקטרוגניות בשריר חלק כלי דם.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף של מטרות תפקודיות על ידי קישור שינויים בפוטנציאל הממברנה לוויסות טונוס כלי הדם.
- ערך ניבויי: תומך במיון תיקי תרכובות באמצעות זיהוי תרכובות הגורמות לדפולריזציה או להיפר-פולריזציה של פוטנציאל הממברנה בעורקים התנגדותיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: הכנת מערכות ביולוגיות מתוקפות (עורק מוח אמצעי עם קנולה) לסריקת תרכובות עם קווי בסיס יציבים של פוטנציאל ממברנה.
- פלט כמותי: הפקת מדידות הדירות של פוטנציאל ממברנה במיליוולט, המאפשרות ניתוח של תגובת-מינון עבור חומרים פרמקולוגיים.
- שחזוריות הסריקה: סטנדרטיזציה של טכניקת ההחדרה בכלי הדם כדי להבטיח קריאות אלקטרופיזיולוגיות עקביות לצורך תיקוף פגיעות (hit validation).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: רלוונטי למודלים של כלי דם חולים להערכת תפקוד לקוי של תעלות יונים במצבים של יתר לחץ דם, שבץ מוחי או דלקת כלי דם.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין מנגנונים אלקטרופיזיולוגיים לתוצאות תפקודיות, כגון ויסות זרימת הדם המוחית.
- החלטות מותאמות סיכונים: מספק מידע לקריטריונים של קבלת החלטות (go/no-go) בהתבסס על שינויים בפוטנציאל הממברנה המושרים על ידי תרכובות הבדיקה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה נכללת ברצף הגילוי, החל מקישור למטרה ועד לאישור תפקודי בעורקים העמידים, ובכך היא תומכת בזיהוי מובילים (leads) ובהערכת יעילות פרה-קלינית.
- ביולוגיה של הגילוי: בוחן השערות מכניסטיות לגבי תרומתם של תעלות יונים לפוטנציאל הממברנה במצב מנוחה בשריר חלק כלי דם.
- סריקה: מספקת תכשירים מוכנים לבדיקה עם הקלטות דקירה (impalement) יציבות לסריקת ספריות של תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת קריאות כמותיות של פוטנציאל הממברנה (mV) המאפשרות השוואה של השפעות תרכובות על עירור כלי הדם.
- מחקר תרגומי: מקשר בין מודולציה אלקטרופיזיולוגית לבין בדיקות תפקודיות של טונוס כלי הדם ופרפוזיה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה אלקטרופיזיולוגית הניתנת לשימוש חוזר עבור מיטות כלי דם ומודלים של מחלות מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בפרמקולוגיה של כלי הדם על ידי מדידה ישירה של ההשלכות האלקטרופיזיולוגיות של מודולציית המטרה.
- ערך תפעולי: מספק נתונים סטנדרטיים וניתנים לשחזור של פוטנציאל ממברנה בין מעבדות ובין תכשירי כלי דם שונים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות לגבי המשך פיתוח (go/no-go) על ידי זיהוי מוקדם של השפעות אלקטרופיזיולוגיות לא ספציפיות (off-target) בשלב הגילוי.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר קידום מותאם סיכונים של תרכובות עם פרופילי בטיחות וסקולריים נוחים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהכנת מיקרו-אלקטרודות, בדיסקציה של כלי דם ובהקלטות אלקטרופיזיולוגיות.
- תלוי באלקטרומטרים עם רעש נמוך, דיגיטייזרים, מיקרו-מניפולטורים ומערכות דימות נטולות רעידות.
- מחייב סטנדרטיזציה של קריטריונים להצלחת החדירה (למשל, יציבות למשך 30 שניות, חזרה לאפס) בין המשתמשים השונים.
- התאמה לעורקי התנגדות אחרים (למשל, עורקי המזנטרום או עורקי הלב) עשויה לדרוש קניולציה ספציפית לכלי הדם והשוואת טונוס.
- מוגבל על ידי שיעור ההצלחה הטכני של החדירה והפגיעות לארטיפקטים של תנועה במהלך ההקלטה.
