אינדוקציה ואפיון של יתר לחץ דם ריאתי בעכברים באמצעות מודל Hypoxia/SU5416
3 ביוני 2020
פרוטוקול זה מתאר אינדוקציה של יתר לחץ דם ריאתי (PH) בעכברים בהתבסס על החשיפה להיפותוקסיה והזרקת אנטגוניסט קולטן VEGF. בעלי החיים לפתח PH וחדר ימין (RV) היפרטרופיה 3 שבועות לאחר החניכה של הפרוטוקול. כמו כן מוצג האפיון הפונקציונלי והמורפומטרי של המודל.
פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לגרום יתר לחץ דם ריאתי ולבצע מדידות תפקודיות של החדר הימני. מודל היפוקסיה סוגן קל ליישם והוא יכול recapitulate כמה סימני ההיכר של יתר לחץ דם ריאתי בתוך שבועיים עד שלושה שבועות של אינדוקציה. באמצעות מודל זה, אנו יכולים לזהות מסלולים חדשים המעורבים בהתפתחות המחלה.
אנחנו יכולים לזהות מטרות חדשות ולבדוק את הפוטנציאל הטיפולי שלהם. לפני תחילת הליך אינדוקציה, לאבטח מיכלי חנקן ליד התא hypoxic ולהגדיר את בקר החמצן בנקודה של 10%חמצן. לאחר מכן, לטעון פתרון SU5416 מוכן טרי לתוך מזרק אחד מיליליטר מצויד מחט 25 מד ידני לרסן את החיה הראשונה להיות מוזרק.
לתפוס את העור כדי ליצור אוהל במקביל עמוד השדרה הקפדה לתפוס את החלק האחורי של הראש בחוזקה, כדי למנוע פגיעה פוטנציאלית לנשוך על ידי העכבר. הכנס את המחט תת עורית מעל האגף על קפל העור רופף במקביל לעור ולספק 100 microliters של תוכן המזרק. לאחר 10 שניות, למשוך את המחט ולהחזיר את החיה לכלוב שלה.
כאשר כל החיות הוזרקו, מניחים את העכברים בתא היפוקסיה מאוורר. לחשיפה להיפוקסיה, ודאו כי התאים מצוידים בחיישן חמצן למדידת רמת החמצן ולפתיחת התאים למשך לא יותר מ-20 דקות כל שלושה ימים לניקוי והוספת מזון ומים. בדוק בעלי חיים מדי יום לסימני לחץ וחזור על הזרקת SU5416 מדי שבוע במשך שלושה שבועות רצופים.
לפני התחלת הליך מדידת הלחץ, להכין את מחבר צינור Y ולהשתמש במצב הידני כדי לבדוק את הפונקציה של מכונת ההנשמה. הגדר את הלחץ ההשראה פחות מס"מ אחד של מים כדי למנוע barotrauma ולהגדיר את קצב הנשימה ל 110 נשימות לדקה. חותכים קטטר תוך וסקולרי 20 מד כדי ליצור צינור אנדוטראצ'ל ולהדליק את יחידת בקרת עוצמת הלחץ.
ליזום את התוכנה לרכישת נתונים ולמקום את קטטר נפח הלחץ בצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר של PBS באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן כייל את הקטטר בהתאם לפרוטוקול היצרן. מניחים את העכבר על משטח חימום ומ מניחים בדיקה רקטלית לניטור טמפרטורת הגוף.
לאחר מכן, לאשר חוסר תגובה קמצוץ בוהן בעכבר הרדמה לגלח את הצוואר ואת אזורי החזה. לאבטח את הגפיים של העכבר עם סרט כירורגי ולעשות חתך של סנטימטר אחד בעור צוואר הרחם המדיקל. באמצעות מוליך כותנה, בבוטות להפריד את parotid ו בלוטות הרוק submandibular לחשוף את השרירים מתחת קנה הנשימה.
בזהירות לחתוך את השרירים כדי לחשוף באופן מלא את קנה הנשימה ולהשתמש מספריים לעשות חתך קטן בין הסחוסים קנה הנשימה. הכנס את צינור אנדוטראצ'ל מוכן ולהסיר את מדריך המתכת של קטטר תוך וסקולרי. לאחר מכן חבר את הקטטר למכונת ההנשמה ואמת את מיקום צינור קנה הנשימה על ידי ניפוח ידני של הריאות.
אבטח את המיקום עם קלטת. למדידת לחץ החדר הימני, בצע חתך עור של סנטימטר אחד מעל תהליך xiphoid והבטן העליונה ומתחיל בקו האמצעי דיסטלי כדי xiphoid בזהירות נעה באופן צדדי משני הצדדים, להפריד את העור על החזה ואת דופן הבטן. פותחים את חלל הבטן, חותכים את הסרעפת בזהירות, דואגים לא לפגוע בלב הפועם או בריאות.
ולהשתמש במוליך כותנה הטה להסיר בעדינות את pericardium. הביאו את קטטר הלחץ ליד העכבר ולהשתמש במוליך כותנה עם קצה מצויד במחט כדי להפוך פצע דקירה בחלק הדיסטלי הלא טיפוסי של החדר הימני. בזהירות להחליף את המחט עם קטטר לחץ, החדרת קטטר הלחץ במקביל לכיוון החדר הימני עם הקצה מול עורק הריאה.
צפה מעקב גל הלחץ כדי להבטיח מיקום נכון של הקטטר. לאחר שאות הלחץ התייצב, השהה את הנשימה והשג לפחות שלוש מדידות. כאשר כל המדידות נרשמו, בזהירות להחזיר את הקטטר לצינור צנטריפוגה מלא PBS באמבט המים.
כאן מוצגים עקומות לחץ ייצוגיות וניתוח כמותי של הלחץ בחדר הימני בסוף תקופת התצפית. ניתוח היסטולוגי של עורקי ריאה משופץ לאחר היפוקסיה בתוספת טיפול SU5416 מגלה עלייה בעובי הקיר המדילי בהשוואה לבעלי חיים נורמוקסיים. נבט חיטה agglutinin כתמים כדי להעריך היפרטרופיה cardiomyocyte מציין כי היפוקסיה בתוספת SU5416 חשיפה תוצאות עלייה ניכרת בגודל cardiomyocyte והיפרטרופיה חדרית ימין.
יתר על כן, הערכה מורפומטרית של היפרטרופיה חדרית נכונה על ידי מדידת מדד פולטון מאשרת עלייה בהיפרטרופיה חדרית נכונה בבעלי החיים היפוקסיים. ביצוע המדידות הפונקציונליות חשוב כדי למנוע דימום כי זה יכול להשפיע לרעה על תוצאות המחקר. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לגרום יתר לחץ דם ריאתי בחולדות עם שינויים קלים בלבד.
יש לציין, רק זריקת סוגן אחת בחולדות מספיקה כדי לגרום יתר לחץ דם ריאתי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר השראה של יתר לחץ דם ריאתי (PH) בעכברים באמצעות חשיפה להיפוקסיה והזרקה של antagoniסט לקולטן VEGF. המודל מאפשר אפיון תפקודי ומורפומטרי של PH והיפרטרופיה של החדר הימני בתוך שלושה שבועות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה קרדיווסקולרית
- פתופיזיולוגיה
רקע
- יתר לחץ דם ריאתי הוא מצב חמור המשפיע על מערכת הלב וכלי הדם.
- הבנת המנגנונים העומדים מאחורי PH עשויה להוביל למטרות טיפוליות חדשות.
- מודל Sugen Hypoxia הוא שיטה נפוצה לחקר PH בעכברים.
- מעכבי קולטני VEGF ממלאים תפקיד בהתפתחות של PH.
מטרת המחקר
- להשראת יתר לחץ דם ריאתי במודל עכברים מבוקר.
- לביצוע מדידות תפקודיות של החדר הימני.
- לזיהוי מסלולים חדשים ומטרות טיפוליות עבור PH.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- השראה של היפוקסיה על ידי קביעת רמות החמצן ל-10%.
- הזרקת SU5416 לחסימת רצפטורי VEGF.
- ניטור תפקוד ומורפולוגיה של החדר הימני.
- אפיון המודל לאורך תקופה של שלושה שבועות.
תוצאות עיקריות
- התפתחות של יתר לחץ דם ריאתי והיפרטרופיה של החדר הימני.
- מדידות תפקודיות מעידות על שינויים משמעותיים בביצועי החדר הימני.
- נצפו שינויים מורפולוגיים התואמים ליתר לחץ דם ריאתי.
- זיהוי של מטרות טיפוליות חדשות פוטנציאליות לטיפול.
מסקנות
- מודל ההיפוקסיה של Sugen מדמה ביעילות יתר לחץ דם ריאתי.
- ניתן להשתמש במודל זה כדי לבחון מסלולים חדשים המעורבים ב-PH.
- מחקרים עתידיים יכולים להשתמש במודל זה לבדיקה טיפולית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודל העכביש של היפוקסיה/SU5416 מספק מערכת מהירה ומשתלמת לבחינת רמיodeling וסקולרי ותפקוד לקוי של החדר הימני בהידראליות ריאתית, ובכך מאפשר תיקוף של מטרות בשלב מוקדם והפחתת סיכונים מכניסטיים. התאימות שלו לעכברים מסוג wild-type ועכברים שעברו שינוי גנטי תומכת בבחינת מסלולים ובבדיקת היפותזות טיפוליות בתוך מסגרת זמן של שלושה שבועות. מודל זה מגשר בין ביולוגיה של גילוי להערכה פרה-קלינית על ידי אספקת מדדים המודינמיים והיסטולוגים כמותיים, המסייעים במיון תיקי מוצרים ובקבלת החלטות מותאמת סיכונים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של מסלולי השמירה של VEGF וזיהוי של מטרות טיפוליות חדשות המעורבות בשינוי מבני (remodeling) של כלי הדם הריאתיים.
- ערך תפעולי: תומך בסריקה פנוטיפית מהירה של התערבויות גנטיות או פרמקולוגיות באמצעות נהלי השראה ומדידה סטנדרטיים.
- ערך ניבוי: מסייע בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי מידול של סימנים היסטופתולוגיים מרכזיים שליתר לחץ דם ריאתי מקבוצה 1 בבני אדם, כולל עיבוי דופן השכבה המדיאלית והיפרטרופיה של החדר הימני.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר פלטי של משתנים תלויים כמותיים, כגון לחץ חדר ימני באמצעות קטטרליזציה ומדד Fulton להערכת היפרטרופיה.
- ערך תפעולי: מספק מדידות הדירות בעלות שונות נמוכה כאשר הוא משולב עם חשיפה סטנדרטית להיפוקסיה ומינון שבועי של SU5416.
- יכולת הרחבה (Scalability): מאפשר שימוש חוזר בפלטפורמה על פני מודלים של טיפוס בר (wild-type) ומודלים של נטרון (knockout) ללא צורך במומחיות כירורגית, ובכך תומך במסעות של תיקוף מטרות בתפוקה גבוהה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מספק מערכת רלוונטית למחלה המדמה את הפתופיזיולוגיה של יתר לחץ דם ריאתי בבני אדם, ומאפשרת הערכה של מעורבות המטרה (target engagement) ומודולציה של מסלולים ביולוגיים.
- ערך תפעולי: תומך במחקרי מניעה וטיפול באמצעות פנוטיפ הפיך עם חזרה לנורמוקסיה, מה שמאפשר תכנוני שטיפה (washout) וחשיפה חוזרת (rechallenge).
- המשכיות תרגומית: מקשר בין שלבי הגילוי המוקדמים לתיקוף פרה-קליני על ידי אספקת נקודות סיום תפקודיות (לחץ RV) ומבניות (remodeling וסקולרי, היפרטרופיה של קרדיומיוציטים) התואמות לסמנים ביולוגיים קליניים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
המודל משתלב ברצף שבין שלב הגילוי לשלב הפרה-קליני, ובכך הוא תומך בזיהוי מוקדם של מטרות, תיקוף של בדיקות והפחתת סיכונים מכניסטיים לפני אופטימיזציה של תרכובות מובילות.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת השערות של מסלולים תלויים ובלתי תלויים ב-VEGF בהיפרטנסיות ריאתית באמצעות פגיעה וסקולרית הניתנת להשראה ולהפיכה.
- סריקה: מספקת מערכות ביולוגיות מוכנות לבדיקה עם השראה סטנדרטית (10% oxygen, SU5416 שבועי) ותוצאות כמותיות (לחץ RV, מדד Fulton, עיבוי היסטולוגי).
- אנליטיקה: מספקת נתונים המודינמיים פונקציונליים ומדדים מורפומטריים המאפשרים השוואה בין קבוצות והערכת גודל האפקט לצורך תיעוד סדרי עדיפויות של מטרות.
- מחקר תרגומי: מציע תובנה מכניסטית לגבי הסתגלות החדר הימני ושכתוב העורקים הריאתיים, ובכך תומך בהחלטות go/no-go המותאמות לסמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמה פנוטיפית ניתנת לשימוש חוזר לבדיקה איטרטיבית של מטרות על פני מודליות כימוגנטיות או פרמקולוגיות מרובות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה באמצעות מידול של פתופיזיולוגיה וסקולרית ולבבית רלוונטית לבני אדם.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזור באמצעות בקרה סטנדרטית של היפוקסיה, לוח זמנים להזרקה וטכניקות של קטטרציה למדידת לחץ ונפח.
- ערך אסטרטגי: מפחית את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים על ידי אפשור הפחתת סיכונים מוקדמת של מטרות, בהתבסס על שינוי תפקודי ומבני של המחלה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בקידום מותאם סיכונים באמצעות אספקת נתונים מולטי-פרמטריים (לחץ, היפרטרופיה, פיברוזיס) לדירוג אובייקטיבי של המטרה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניהול תא היפוקסיה, טיפול ב-SU5416 וטכניקות של קטטריזציה של החדר הימני.
- תלוי בבקרת חמצן מדויקת (10%) ובגישה למכלי חנקן לצורך תחזוקת התא.
- מחייב טיפול סטנדרטי בבעלי חיים ומתן מינונים שבועיים כדי להבטיח עקביות של המודל בין קבוצות הניסוי.
- מוגבל לחומרת פנוטיפ קלה עד מתונה, מה שעשוי להגביל את המידול של שלבי מחלה מתקדמים.
- ההפיכות עם החזרה לנורמוקסיה מחייבת תכנון ניסויי קפדני עבור מחקרי טיפול כרוניים.
