ניתוח התפתחות קאמרית הלב במהלך מופרה העכבר באמצעות כל הר Epifluorescence
17 באפריל 2019
אנו מציגים את הפרוטוקולים לבחון התפתחות הלב העכבר באמצעות מיקרוסקופ פלורסנטי הר שלם על העכבר עוברי גזור מן חדרית ספציפי MLC-2v-tdTomato כתב טוק-אין עכברים. שיטה זו מאפשרת לנו לבצע בכל שלב של היווצרות חדרית במהלך התפתחות הלב העכבר מבלי מהגידולים שיטות מעבדה הומנית.
באמצעות שיטה זו אנו יכולים ישירות בדיקה היווצרות צינור הלב, לולאה, היווצרות תא מלא ללא מניפולציות ניסיוניות נוספות של עובר העכבר. אמנם, אנו משתמשים MLC-2v-tdTomato עכברים כדוגמה, שיטה פשוטה זו יכולה להיות בשימוש נרחב עם קווי עכבר כתב פלואורסצנטי אחרים. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שזה פשוט מאוד ואינו דורש שום טכניקות מורכבות או ציוד.
זה יכול להתבצע בהגדרת מעבדה רגילה. לאחר הזדווגות נקבה עם עכברים זכרים, שניהם MLC-2v-tdTomato 8 עד 10 שבועות, לבדוק את הסכרים עבור תקעים בנרתיק בכל בוקר. הניחו את הסכרים ההריונים, המתת דם בימים שונים לאחר הקוטום, בתמרורי סופין וריסוס הבטן עם 70% אתנול.
השתמש מספריים כירורגיים חדים מדפים כדי לפתוח את חלל הבטן על ידי חתך של העור והן את דופן הבטן. לאחר איתור קרני רחם דו-צדדיות בחלק הגבי של חלל הבטן, הפרד את הרחם כולו באמצעות מספריים כירורגיים חדים ומדפים לחתוך בזהירות מעל oviducts משני הצדדים. מניחים את הרחם כולו נותח בצלחת פטרי 10 ס"מ עם PBS קר כקרח.
באמצעות מספריים כירורגיים חדים ומלקחיים, בזהירות להפריד כל שאק מי המיצוק לאורך קרן הרחם. השתמש פינצטה כדי להעביר כל עובר לתוך צלחת תרבות 35 מילימטר מלא PBS קר כקרח. באמצעות מספריים ומלקחיים כירורגיים חדים, פתח את שיכר מי המיצוק וחשוף כל עובר על ידי ניתוק חבל הטבור ולאחר מכן לקצץ רקמות עובריות נוספות ככל האפשר מבלי לפגוע בעוברים.
תחת מיקרוסקופ ניתוח עם מאיר מיקרוסקופ סיבים אופטיים, לחתוך את ראשו של העובר ולהעביר אותו צינור 1.5 מיליליטר עם 100 microliters של חיץ A עבור genotyping מאוחר יותר כדי לתאם עם התוצאות של הדמיה epifluorescent. באמצעות מדפים עדין, לפתוח את החזה של העובר. עם מספריים כירורגיים חדים ומדפים, להסיר את הלב מן הריאות ואת כלי הדם.
השתמש פינצטה כדי להעביר את הלב העוברי נותק לתוך צלחת תרבות 35 מילימטר עם PBS. מניחים את הצלחת עם לבבות עובריים עכבר תחת מיקרוסקופ ניתוח epifluorescent. השתמש במטלות עדין כדי למקם את הלבבות העובריים כך פיתוח החדרים פונים הבוחן.
התאם את המוקד באמצעות מטרה של 0.63x במצב שדה בהיר. צלף חשיפות של שדות בהירים וללכוד תמונות מרובות. כדי לדמיין ביטוי tdTomato, כבה מאיר מיקרוסקופ סיבים אופטיים והגדר את המסנן עבור פלואורסצנטיות אדומה.
התאימו מחדש את התמקדות התמונה במידת הצורך, התאימו את הבהירות והניגודיות, צלמו חשיפות פלואורסצנטיות אדומות ולכדו תמונות מרובות. עבור genotyping עובר, להרתיח דגימות ראש מבודדות בעבר במאגר A ב 100 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. צנטריפוגה במשך שתי דקות ב 11, 360 פעמים G.Transfer 20 microliters של על טבעי לתוך צינור חדש 1.5 מיליליטר עם 20 microliters של חיץ B ומערבבים.
השתמש 4.5 microliters של supernatant מעורב כתבנית DNA ולשלב אותו עם 0.5 microliters של כל אחד 10 מיקרומולרים ספציפיים קדימה והפכו פריימרים, 10 microliters של פולימראז 2x-premixed ומאגר תגובה ולאחר מכן להוסיף מים לנפח כולל של 20 microliters. הפעל PCR כמתואר בכתב היד. לטעון את התגובה הושלמה 100 סולם DNA זוג בסיס על 1% ג'ל agarose ולהפעיל ב 140 וולט ב 1x TAE חיץ במשך 25 דקות.
מניחים את הג'ל שהושלם על טרנסילומינטור UV ולהדליק את אור UV כדי לזהות את להקות DNA. MLC-2v נחשב הסמן המוקדם ביותר עבור מפרט התא חדרי במהלך התפתחות הלב. ב MLC-2v-tdTomato כתב לדפוק בעכברים, ביטוי חלש יחסית של tdTomato בצינור הלב ליניארי ב E8.0 מתחזק ב E8.5 כפי שמוצג באמצעות הדמיה אפיפלורסנטית כל הר של העוברים.
באמצעות הדמיה אפיפלורסנטית כולה של הלב המנותק, ניתן לקבוע בקלות היווצרות תא חדרית במהלך התפתחות לב העכבר. בלב המנותח של עובר עכבר שלם ב- E10.5, ביטוי הכתב MLC-2v-tdTomato הוצג בחלק החדרי של הלב ולא בדרכי הזרימה, בדרכי הזרימה או באטריה העתידית. ב E12.5 כדי E13.5, כתב tdTomato בא לידי ביטוי באופן בלעדי בחדרי הלב ארבעה תאים.
תבנית הביטוי הדומה ספציפית חדרית הוצגה בעובר העכבר המנותק ב- E16.5. לאחר הדמיה שלמה, גנוטיפ של העוברים נקבע באמצעות שני סטים של פריימרים עבור PCR genotyping, המאשר עוברים הומוזיגים הנושאים את אלל דפיקות tdTomato, הטרוזיגים, ואת העוברים מסוג פראי. שיטה זו היא די פשוטה ופשוטה לביצוע.
הצעד הקריטי הוא לנתח לבבות עובריים. הבנת אנטומיה לבבית במהלך התפתחות הלב יש צורך לבודד בהצלחה את הלב מן העובר כולו.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקולים לבחינת התפתחות לב בעכברים באמצעות מיקרוסקופיה אפי-פלואורסצנטית של דגימות שלמות (whole mount) בעכברי reporter knock-in מסוג MLC-2v-tdTomato. השיטה מאפשרת ויזואליזציה ישירה של שלבי היווצרות החדרים ללא צורך בטכניקות היסטוכימיות מורכבות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- מחקר קרדיווסקולרי
רקע
- התפתחות הלב היא תחום מחקר קריטי בביולוגיה התפתחותית.
- שיטות מסורתיות לחקר מורפולוגיית הלב עשויות לדרוש עבודת כפיים רבה.
- עכברי דגימה עם רפורטר פלואורסצנטי מספקים גישה חדשנית להדמיית מבני לב.
- עכברי MLC-2v-tdTomato משמשים כמודל יעיל למחקרים אלו.
מטרת המחקר
- מתן שיטה פשוטה להדמיה של שלבי התפתחות הלב.
- הדגמת התועלת של עכברים עם רפורטר פלואורסצנטי במחקרי התפתחות.
- הקלה על המחקר ללא צורך בטכניקות מורכבות.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- מיקרוסקופיה אפי-פלואורסצנטית של דגימות שלמות (Whole mount).
- שימוש בעכברי knock-in עם רפורטר MLC-2v-tdTomato.
- דיסקציה של עוברים בשלבים שונים של ההתפתחות.
- מערך ניסויי פשוט המתאים לסביבות מעבדה רגילות.
תוצאות עיקריות
- ויזואליזציה מוצלחת של היווצרות צינור הלב והקיפול שלו.
- תצפית ברורה על היווצרות מלאה של הלשכות.
- שיטה הניתנת ליישום בקווי עכברים אחרים עם רפורטר פלואורסצנטי.
- הפרוטוקול הדגים קלות שימוש בתנאי מעבדה סטנדרטיים.
מסקנות
- השיטה המוצגת מפשטת את חקר התפתחות הלב.
- היא מאפשרת לחוקרים להדמיות של שלבים קריטיים ללא פרוצדורות מורכבות.
- גישה זו יכולה לשפר את ההבנה של המורפוגנזה של הלב.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מאפשר ויזואליזציה ישירה של היווצרות חללי הפרוקי של הלב בעוברים של עכברים באמצעות קווי דגמי דווח פלואורסצנטיים, ובכך תומך בתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים של גילוי תרופות למערכת קרדיו-וסקולרית. על ידי פישוט הערכת המורפולוגיה של הלב ללא צורך בהיסטוכימיה מורכבת, הוא משפר את הפחתת הסיכונים המכניסטיים של מסלולים התפתחותיים. גישה זו מספקת ביטחון חיזוי להערכת השפעות של תרכובות על מורפוגנזה לבבית במודלים פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של מנגנוני ההגדרה של הפרוזדורים באמצעות MLC-2v כסמן מוקדם להתפתחות חללי הלב.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי קישור ישיר בין רפורטרים גנטיים לבין היווצרות מבנית של הלב.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: הכנת מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לסריקת תרכובות בהמשך, באמצעות קביעת מורפולוגיה ונטריקולרית בסיסית.
- ערך תפעולי: מאפשר סטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות דימוי אפי-פלואורסצנטי של דגימות שלמות (whole-mount) הניתן לשחזור לאורך שלבי הפיתוח.
מחקר טרנסלציונלי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מספק מערכת רלוונטית למחלה לחקר מסלולי מורפוגנזה לבבית שמורים בקרב חולייתנים.
- ערך תפעולי: מקל על סנכרון של סממנים ביולוגיים (biomarkers) תרגומיים על ידי הקשר בין ביטוי tdTomato לבין הבשלת חללי הפרונטריקולר.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של ביולוגיה גילויית על ידי כך שהיא מאפשרת הערכה ישירה של פנוטיפים מבניים של הלב בעקבות הפרעה גנטית או פרמקולוגית.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבחינת השערות לגבי גנים או תרכובות המשפיעים על קיפול צינור הלב ועל מחיצת הפרוזדורים והחדרים.
- סריקה: מספק קריאות פלואורסצנציה כמותיות להשוואת היווצרות החדרים בתנאים ניסיוניים שונים.
- אנליטיקה: מייצר מדידות מרחביות ומבוססות עוצמה של ביטוי tdTomato להערכת הספציפיות של החדרים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין תבניות ראשוניות של החדרים להמשכיות פרה-קלינית באמצעות מנגנוני התפתחות שמורים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמת דימוי ניתנת לשימוש חוזר, הישימה למספר קווי רפורטר פלואורסצנטיים מעבר ל-MLC-2v-tdTomato.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות בהערכת היווצרות חללי הפרונטריקולר.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות פרוטוקולי דיסקציה ודימות סטנדרטיים בסביבת מעבדה רגילה.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לקבלת החלטות מוקדמות של המשך או הפסקה (go/no-go) בהתבסס על פנוטיפים מבניים של הלב.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים על ידי זיהוי ליקויי התפתחות בתרכובות מובילות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדיסקציה של עוברים של עכברים ובזיהוי אנטומיה לבבית.
- תלוי במיקרוסקופיה אפי-פלואורסצנטית עם סטים של מסננים מתאימים לזיהוי tdTomato.
- מחייב סטנדרטיזציה של שלבי התפתחות העובר ושל נהלי בידוד הלב בין המשתמשים השונים.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום על קווי רפורטר פלואורסצנטיים שונים בעלי דפוסי ביטוי משתנים.
- מוגבל בשל הצורך בגישה לרקמה עוברית, מה שמגביל את השימוש למחקרי התפתחות ex vivo.
