מודל בלתי מתורבת לחקר הצבירה של הטאו באמצעות מתווך-התמרה בתיווך של הנוירונים האנושיים
23 במאי 2019
פרוטוקול זה מפרט הליך שבו התרבויות הנוירואליות של האדם מוטדיקות באמצעות בנייה ויראלית קידוד עבור מוטציה האדם האנושי. התמרה של תרבויות התצוגה ביחידות האוניברסיטה והפתווגיות הקשורות.
בפרוטוקול זה אנו מפרטים מודל במבחנה של טאופתיה אנושית. שיטה זו ממלאת צורך בחומרים אשר עשוי להיות שימושי עבור הקרנת תרופות מחקרים מנגנון המחלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי פרדיגמת תרבות התא מאפשר הערכה מהירה יותר של רעילות טאו וטיפולי טאו פוטנציאליים בהשוואה למחקרים בבעלי חיים כדי להתחיל בהליך זה להפשיר את ציפוי מטריצת קרום המרתף עבור צלחות תרבות בארבע מעלות צלזיוס.
הפוך aliquots מיליליטר ולאחסן אותם במינוס 20 או מינוס 70 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, מחדש את גורם הגדילה fibroblast הבסיסי PBS סטרילי בריכוז של 10 מיקרוגרם למיליליטר. הפוך 10 microliter aliquots ולאחסן אותם בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן קבעו בקבוק חדש של DMEM-F12 שלא נפתח ב-500 מיליליטר עם גלוטמין. הוסף 10 מיליליטר של B27, חמישה מיליליטר של N2, וחמישה מיליליטר של פניצילין-סטרפטומיצין כדי להכין מדיה תאי גזע עצביים. מניחים 50 מיליליטר של התקשורת של המל"ל לתוך צינור חרוט, ולהוסיף 10 microliters של bFGF מוכן.
אחסן את המל"ל הזה בתוספת מדיה bFGF בארבע מעלות צלזיוס. ראשית, להסיר aliquot של ציפוי מטריצת קרום מרתף קפוא עבור צלחות תרבות התא מהמקפיא וזה מאפשר להפשיר בארבע מעלות צלזיוס. הוסף 385 מיקרוליטרים של ציפוי מטריצת קרום המרתף המופשר לחמישה מיליליטר של מדיית DMEM-F12 המכילה פניצילין-סטרפטומיצין.
אם תאים מופשרים מהמלאי הקפוא של המל"ל, קחו בקבוקון של תאים קפואים מהמקפיא וחממו אותו באמבט מים מחומם ל-37 מעלות צלזיוס על ידי הזזת הבקבוקון קדימה ואחורה במים. לאחר מכן, לרסס את הבקבוקון עם 70% אתנול. לאחר מכן, מתחת למכסה המנוע של תאים, העבר את התאים לכ-10 מיליליטר של מדיית DMEM-F12 המכילה פניצילין-סטרפטומיצין.
צנטריפוגה בטמפרטורת החדר ב 1, 000 פעמים גרם במשך חמש דקות. לאחר מכן שאף את התקשורת ולחץ מחדש על התאים בתקשורת המל"ל. לדלל את התאים בתקשורת המל"ל כדי להשיג את צפיפות הזריעה המתאימה עבור כלי תרבות התאים המשמש.
הוסף מספיק תאים תלויים בתקשורת המל"ל כדי לזרוע את מטריצת קרום המרתף מצופה מנות תרבות. לגדל את התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני עד שהם 75 עד 80% confluent, הקפד לשנות את התקשורת כל יומיים. כדי לשנות נוירונים עם lentivirus, השתמש בספירת טיטר של 340, 000 יחידות מתמשלות לכל תא.
לדלל את היחידות מתמר במדיה תרבות התא לריכוז הדרוש, ולהוסיף אותם לתאים. יומיים לאחר הוספת lentivirus, לשטוף את התאים פעם אחת עם מדיה טרייה שאינה מכילה bFGF. המשך culturing התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני במדיה ללא bFGF.
לשמור על התאים במשך כשמונה שבועות לאחר ההתמרה, הקפד לשנות את המדיה תרבות התא כל יומיים. השתמש במיקרוסקופ אור כדי לדמיין את התאים באופן שגרתי ולהבטיח את הכדאיות. לאחר ההעתקה, להסיר את מנות התרבות מן החממה הקפד לשמור על המכסה עליהם כדי לשמור על התרבות סטרילית היטב.
השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי המסוגל להדמיית תאים חיים כדי לדמיין את התאים תחת מטרה של פי 10 עם גירוי של 514 ננומטר ומסנן פליטה של 527 ננומטר. במחקר זה נוירונים מתומרים עם טאו-RDLM-YFP lentivirus מתויגים באופן פלואורסצנטי עם YFP. תרבויות שעברו התמרה של RDLM מוצגות כדי להציג אגרגטים לאחר ההתמרה.
תכלילים אלה כתם חיובי עבור thioflavin. דידול עצבי מאושר על ידי immunolabeling של הסמן הספציפי לנוירונים בטא-tubulin III בתרבויות. חשוב לזכור כי נוגדנים משניים מתויגים באופן פלואורסצנטי צריכים להיות ספקטרום פליטת עירור שאינו חופף לזה של YFP.
למרות אגרגטים טאו פלואורסצנטי צהוב יהיה גלוי בהיעדר כתמים, thioflavin צריך לשמש גם להדמיה על מנת לאשר כי האות פלואורסצנטי הוא טאו מצרפי ולא פסולת הסלולר. לאחר הדור של תאים מדכאים יתר על כן טאו, ניתן לבצע מספר הערכות של בריאות עצבית וצבירת טאו. לדוגמה, מצאנו כי תאים אלה מציגים ניוון אקסונאלי.
בנוסף למחקרים על תרבות התאים, השתמשנו בשיטה זו כדי לבחון את הפתוגניות של טאו שמקורו באקסוזומלית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מתווה פרוטוקול להקמת מודל in vitro של טאוופתיה אנושית באמצעות טרנסדוקציה של תרביות נוירונליות עם מבנים לנטיוויריליים המקודדים לטאו אנושי מוטנטי. המודל מאפשר הערכה מהירה של רעילות הטאו ושל טיפולים פוטנציאליים בהשוואה למחקרים מסורתיים בבעלי חיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- טאופתיות
רקע
- טאופתיות אנושיות הן מחלות ניווניות של מערכת העצבים המאופיינות בצבירה של חלבון tau.
- מודלים מסורתיים כרוכים לרוב בלוחות זמנים ממושכים ולא תמיד משקפים את הפתולוגיה האנושית.
- פרוטוקול זה מציג פרדיגמה להערכה מהירה וספציפית יותר באמצעות תרביות תאים.
- הוא נותן מענה למגבלות של מודלים בבעלי חיים בחקר אינטראקציות של חלבון tau.
מטרת המחקר
- פיתוח מודל תרבית נוירונים אנושיים לחקר פתולוגיית tau.
- סיוע בסינון תרופות למחלות הקשורות ל-tau.
- קידום ההבנה של תפקידו של tau בניוროדגנרציה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הפלטפורמה שנעשה בה שימוש היא מערכת תרבית של תאי עצב אנושיים.
- המודל הביולוגי מורכב מנוירונים אנושיים שהועברו להם גני tau מוטנטיים באמצעות קונסטרוקטים לנטיביריאליים.
- בטקסט לא מוזכר תהליך עבודה של מולטי-אומיקה (multiomics).
- התאים נשמרים למשך כשמונה שבועות לאחר התעתוק, תוך החלפות תקופתיות של המצע.
- מיקרוסקופיה באור ופלואורסצנציה משמשות להדמיית אגרגציה של tau.
תוצאות עיקריות
- בתרביות שעברו טרנסדוקציה נצפו צברי tau, אשר אושרו באמצעות צביעת thioflavin.
- הדיפרנציאציה הנורונלית אומתה באמצעות סימון אימונו-כימי של beta-tubulin III.
- התצפיות הצביעו על דגנרציה אקסונלית בקרב התאים עם ביטוי יתר של tau.
- המחקר מדגיש את ההיתכנות של שימוש במודל זה להערכת בריאות נוירונלית הקשורה ל-tau.
מסקנות
- מחקר זה מדגים גישה אמינה in vitro לחקר טאו-פתיות (tauopathies) ולהערכת רעילות של חלבון tau.
- המודל שפותח פותח נתיבים לבדיקת תרופות פוטנציאליות לטיפול ב-tau.
- התובנות שהושגו יכולות לשפר את ההבנה של המנגנונים העומדים מאחורי אגרגציה של tau וניוון עצבי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודל נוירונים אנושי זה in vitro נותן מענה לפער קריטי במחקר של טאו-פתיות (tauopathies) על ידי אספקת מערכת רלוונטית לבני אדם להערכה מהירה של אגרגציה של tau ונוירו-טוקסיות. הוא מאפשר תיקוף של מטרות בשלב מוקדם והפחתת סיכונים מכניסטיים עבור טיפולים המכוונים ל-tau, ובכך מפחית את ההסתמכות על מחקרי בעלי חיים ממושכים. המודל תומך בביטחון חזוי בזיהוי מועמדים מובילים (lead identification) ובמיון פרה-קליני עבור תוכניות למחלות נוירודגנרטיביות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן מוטציות פתוגניות של חלבון tau בנוירונים אנושיים על מנת לתקף מטרות טיפוליות ולהבהיר מנגנוני אגרגציה.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות מדדים כמותיים, כגון שינויים באורך האקסון ובנפח הליזוזומים.
- ערך חיזוי: תומך במיון תיקי פיתוח באמצעות מידול של פתולוגיית tau ופרופילי רעילות הספציפיים לבני אדם.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצר אגרגטים של tau סטנדרטיים המסומנים פלואורסצנטית, הניתנים לזיהוי באמצעות צביעת YFP ות'יופלאבין (thioflavin), לצורך סריקת תרכובות.
- פלט כמותי: מאפשר מדידה של עומס האגרגציה ושל פנוטיפים נוירו-טוקסיים כמשתנים תלויים בבדיקות תגובה למינון.
- יכולת הרחבה (Scalability): טרנסדוקציה לנטיוירילית מאפשרת הכנה עקבית וניתנת להרחבה של תרביות נוירונליות הרלוונטיות למחלה עבור סריקה בעלת תוכן גבוה (high-content screening).
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- רלוונטיות למחלה: שימוש בנוירונים אנושיים המבטאים מוטציות פתוגניות של tau למידול אירועים מוקדמים במחלת אלצהיימר ובטאופתיות קשורות.
- רציפות תרגומית: מגשר בין שלב הגילוי לעבודה פרה-קלינית על ידי אספקת מערכת תאית אנושית למחקרי מנגנון פעולה.
- החלטות מותאמות סיכון: מאפשר הערכה של תרכובות המכוונות ל-tau במערכת המציגה אגרגטים חיוביים ל-thioflavin וניוון של נוריטים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
המודל משתלב ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה, דרך זיהוי מוביל ועד לבדיקת יעילות פרה-קלינית, ובכך הוא תומך במחזורי תכנון-ביצוע-בדיקה (design-make-test) איטרטיביים עבור מווסני tau.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי מוטציות ב-tau ובבירור מסלולים באמצעות הדמיה של תאים חיים של סמני אגרגציה ורעילות.
- סריקה: מספק תרביות מוכנות לבדיקה עם פנוטיפים סטנדרטיים של טרנסדוקציה ואגרגציה להערכה של ספריות תרכובות.
- אנליטיקה: מספק משתנים תלויים כמותיים, כולל עומס אגרגטים פלואורסצנטיים, אורך אקסוני ונפח ליזוזומלי להשוואה סטטיסטית.
- מחקר תרגומי: מקשר לתיקוף פרה-קליני על ידי מידול פתולוגיה של tau אנושי במערכת רדוקציוניסטית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר לבדיקת מבני tau מרובים, מעכבים או גישות לעריכה גנטית לאורך פרויקטים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון במטרה על ידי מידול טאוופתיה אנושית עם מוטציות פתוגניות ותיקוף של אגרגטים באמצעות חיוביות לתיופלאבין.
- ערך תפעולי: מציע מערכת יעילה מבחינת עלויות וניתנת לשחזור, עם מצעים מוגדרים, פרוטוקולי טרנסדוקציה ולוח זמנים של שמונה שבועות לתרבית.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או עצירה (go/no-go) על ידי אספקת נתונים מוקדמים על נוירו-טוקסיות ויעילות הרלוונטיים לבני אדם.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר קידום של טיפולים בטאו מותאם סיכון, בהתבסס על קריאות של אגרגציה ודגנרציה של נוריטים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרביות תאי עצב, טרנסדוקציה לנטיביריאלית ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- תלוי בגישה לתאי גזע עצביים אנושיים, וקטורים לנטיביריאליים וציוד דימוג עם מערכות מסננים מתאימות.
- מחייב סטנדרטיזציה של תיתור הטרנסדוקציה (340,000 TU/cell) והרכבי מצעי גידול בין אתרים שונים.
- כולל שיקולי התאמה עבור מוטציות שונות של tau או מבני רפורטר מעבר ל-tau-RDLM-YFP.
- מוגבל על ידי משך תרבית של שמונה שבועות ושונות פוטנציאלית ביעילות היווצרות האגרגטים.
שאלות נפוצות בנושאי ביו-פרמה
Chapters in this video
0:04
Title
0:27
Preparation of Media and Reagents
1:41
Culturing Human Neural Stem Cells
3:12
Transduction and Maintenance of Neuronal Cultures
4:05
Live-cell Imaging
4:32
Results: Analysis of Tau Aggregation Using Lentiviral-mediated Transduction of Human Neurons
5:22
Conclusion
