הפחתת גודל כירורגי של דג Zebrafish לחקר שינוי גודל של תבנית עובריים

למרות קנה המידה הוא אחד התכונות האוניברסליות והבסיסיות של מערכות התפתחותיות, המנגנונים הבסיסיים לא הובנו באיברים ורקמות רבים. טכניקת הפחתת הגודל של דג הזברה המוצגת בסרטון זה תקדם את הבנתכם את המנגנונים שבבסיס תהליכי שינוי קנה המידה הדינמיים. היתרונות בעבודה עם דגי זברה הם שקל לבצע הדמיה חיה, גנטיקה וניתוח כמותי.

הטכניקה שלנו היא גם פשוטה מאוד וקל ליישם ללא כל ציוד מיוחד או אימון אינטנסיבי. בריאות העוברים היא המפתח להצלחה בטכניקה זו. השתמש דגים צעירים כהורים להיזהר למזער את הנזק על ידי הסרת chorions.

וגם לשחק סביב בגודל של הפצע על החלמון, וכמה תאים מוסרים. כמו העוברים אנו משתמשים הם צעירים מאוד שביר, הם צריכים להיות מטופלים בזהירות רבה בעת העברה וחיתוך. יחד עם זאת, זה צריך להיות מהיר כך ההליך יכול להיעשות בחלון הזמן הנכון של הפיתוח.

הדגמה חזותית יכולה לתת תחושה טובה של איך לייצר עוברים קטנים יותר ביעילות. כדי ליצור לולאת תיל לחיתוך עוברים, הזינו חוט נירוסטה נוקשה באורך 20 ס"מ ולא קורוזיבי דרך נימי זכוכית, מה שהופך לולאה קטנה באורך מילימטר אחד בחלק העליון. מניחים טיפה קטנה של לק ברור על קצה נימי הכיתה, בין נימי לולאת חוט להחזיק אותו במקום, הקפדה לא לקבל כל לק על חלק הלולאה, כפי שהוא עלול לפגוע בעוברים.

ואז תן לו להתייבש. השתמשו בקלטת מעבדה כדי לחבר את נימי הזכוכית עם הלולאה על מקל אכילה מעץ, והשאירו כשני סנטימטרים וחצי של נימי הזכוכית המשתרעים מעבר למקל האכילה, כך שחלק מקל האכילה של הכלי לא טובל במים מאוחר יותר. בצלחת פטרי מזכוכית 100 מילימטר עם מרית פלסטיק, להפיץ כ 0.5 מיליליטר של תאית מתיל 2% ליד מרכז התחתון דק באופן שווה לעובי של כ 0.5 מילימטרים.

יוצקים כ-30 מיליליטר של שליש מהתספוס של רינגר לצד המנה, ומאפשרים לה להתפשט לשאר המנה ולכסות את תאית המתיל. מניחים בעבר עוברים de-chorionated בתא 256 לשלב תא K אחד על 2%מתיל תאית, לוודא העוברים מכוונים על הצד שלהם. כדי לקצוץ את בלסטולה, השתמש בלולאת התיל כדי לחתוך ליד מוט החיות, בניצב לציר הצמחייה של בעלי החיים ולנתק כ -30 עד 40% מתאים blastoderm.

לאחר מכן הקישו בעדינות על הקצוות יחד כדי לעזור לתאים הנותרים להידבק לאחור. עבור חלמון, להשתמש בחוט רכוב לעשות פצע קטן ליד מוט צמחי על ידי ניקס קרום הביצה, אשר יגרום החלמון לטפטף החוצה במשך כמה דקות, ולאחר מכן לרפא. כאשר החלמון מפסיק לטפטף החוצה, להשתמש פיפטה כדי להזיז את העובר מחוץ תאית מתיל באותה מנה להתאוששות.

חזור blastula וחיתוך חלמון עבור כל העוברים, ולאחר מכן להשאיר את המנה באין מפריע במשך 30 דקות בעוד העוברים להתאושש. לאחר מכן, השתמש פיפטה זכוכית להעביר את העוברים לצלחת זכוכית 35 מילימטר שהוכן בעבר המכיל פתרון טרי שליש רינגר ולמקום אותם 28.5 מעלות צלזיוס אינקובטור כדי לאפשר התאוששות מלאה לפני שתמשיך עם הדמיה. לאחר ביצוע שני שלבים חיתוך עם blastula וחלמון, עוברים הראו מורפולוגיה הכוללת נורמלי לכאורה לאורך כל השלבים ההתפתחותיים לעומת עוברי הבקרה, מלבד הבדל גודל.

מצד שני, עוברים קצוצים בלבד הראו מורפולוגיה מוזרה, במיוחד בשלבים מוקדמים יותר. במהלך האפיבולי, לעוברים היה מראה מכווץ ומוסט פנימה. בשלב הסופי הבא, מבנים קוויים בינוניים נמצאו שטוחים ברמות אקסיאליות רבות.

בשלבים מאוחרים יותר, מבני הגוף הסמוכים לחלמון, כגון האמצע וההידברבריין עדיין הראו צורה שטוחה יחסית, אולי בשל מתח מוגבר מהחלמון הגדול יחסית. דימות זמן לשגות של היווצרות somite הראה כי הן בשליטה עוברים קצוצים, הגדלים של somites שנוצרו בשלבים מאוחרים יותר היו קטנים יותר בהשוואה לאלה של שלבים קודמים. כמו כן, לאורך כל שלבי היווצרות somite, עוברים קצוצים היו somites קטן יותר מאשר אלה בעוברים שליטה.

כאשר טכניקת החיתוך הדו-שלבית בוצעה על קרום mCherry הזריק עוברים, הדמיה של חוטי השדרה שלהם ב 20 שעות לאחר ההפריה הראה ירידה בגבהים צינור עצבי עקב הפחתת גודל. חיתוך שני שלבים חשוב מאוד להשיג עוברים קטנים יותר אך נורמליים אחרת ביעילות גבוהה. חשוב לזכור לא לקצוץ את החלמון תוך חיתוך תאים מהברסטולה.

עבור חלמון, לעשות פצע זעיר על זה עבור התוכן לטפטף החוצה. וממברנה החלמון תחלים באופן טבעי במאגר הנכון. מכיוון שניתן לשחזר את העוברים הקצוצים במהירות, ניתן ליישם כל שיטה או ניתוח לעוברים רגילים בשיטת הפחתת הגודל.

הפשטות והרבגוניות של טכניקה זו היא חזקה מאוד כמו כל אחד יכול להציג טכניקה זו כדי ללמוד בעיה קנה מידה בכל רקמה או איבר זברה. אנו מאמינים שבטכניקה זו חוקרים יכולים להתמודד עם בעיות קנה מידה במגוון מערכות שלא נגעו בהן בעבר. כבר עשינו תגליות חשובות בהרחבה של דפוסי צינורות עלובים ונוירונים.