מיקוד אלפא Synuclein אגרגטים בתוך עורית היקפיים סיבים עצביים על ידי Free-צפה אימונוofלואונסנציה החופשית
25 ביוני 2019
כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור מערכת ביופסיה בחינם צף של העור על מקטעים לביופסיה של מעטפת המאפשרת זיהוי של מחלות היווצרות המחלה מסוים של מחלת אלפא מעורב במחלת פרקינסון מספר חלבונים של מערכת העצבים ההיקפית
האבחנה של מחלת פרקינסון עדיין מסתמכת על סימנים קליניים של מעורבות מוטורית המופיעים מאוחר יותר במהלך המחלה, כאשר רוב הנוירונים של הסובסטנציה ניגרה כבר הולכים לאיבוד. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח עצבים עוריים על ידי ביופסיה העור, המייצג סמן ביולוגי חדש פוטנציאלי של המחלה, לשמש בניסויים קליניים. ביופסיה של העור היא הליך לא פולשני שניתן להעריך בקלות המאפשר ניתוח של רקמת עצבים היקפית הנוטה לפתולוגיה.
אלפא סינוקליין אגרגטים זיהוי על ידי ביופסיה העור יכול לשמש למטרות אבחון, אולי בשלבים מוקדמים, כאשר תרופה פוטנציאלית היא היעילה ביותר. ביופסיות עור מעקב באותו חולה לאפשר ניתוח זמן קורס מיוחד של אלפא סינוקליין צבירה מתפשטת במערכת העצבים העורית האנושית. אלה יכולים לשפוך אור על הפתוגנזה של המחלה.
כדי להתחיל בהליך זה, הכן פתרון תיקון PLP חדש כמפורט בטבלה אחת של פרוטוקול הטקסט. מיד לאחר איסוף ביופסיה של העור, להטביע אותו בצינור המכיל 10 מיליליטר של הפתרון התיקון. דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס.
למחרת, במכסה המנוע אדים, להסיר את התיקון PLP בעדינות. באותו צינור, לשטוף את הביופסיה שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד, באמצעות חמישה מיליליטר של 0.1 פתרון טוחן של סורנסן עבור כל לשטוף. השלך את הפתרון של סורנסן, והוסף חמישה מיליליטר של פתרון קריופרוטקטנט.
דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, לאחסן את הביופסיה בארבע מעלות צלזיוס אם החתך עם קריוטום יבוצע בתוך שבוע. ראשית, להגדיר את הקריוטום למינוס 20 מעלות צלזיוס.
קח קריומאולד ומלא אותו במדיום להטמיע קריו. באמצעות פינצטה, לטבול את הביופסיה לתוך המדיום ההטבעה קריו, עם ציר האורך מקביל לתחתית cryomold. הצמד להקפיא את המדגם עם חנקן נוזלי, כדי לקבל קוביה מוצקה של מדיום cryo-הטבעה המכיל את הביופסיה בכיוון הנכון.
שים את הדגימה בהקפאטט, ולחכות 30 דקות כדי לאפשר את הביופסיה להתאקלם. לאחר מכן, לתקן את המדגם על קריוסטט לחתוך לקטעים 50 מיקרומטר. בעזרת מברשת קטנה, מעבירים את קטעי ההקפאה לצלחת של 96 בארות המכילה 200 מיקרוליטרים של תותב נגד קפריש בכל באר.
לאחר מכן, לאחסן את הצלחת במינוס 20 מעלות צלזיוס. ראשית, מלאו חלק מה בארות של צלחת טרייה של 96 בארות עם 100 מיקרוליטרים של פתרון כביסה. מעבירים את החלקים לניתוח מצלחת האחסון לזה המכיל את פתרון הכביסה.
השאירו את החלקים בתסרון הכביסה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, מעבירים כל קטע לתוך באר ריקה המכילה את אותו פתרון כביסה, וחוזרים על הכביסה. לאחר מכן, להוסיף פתרון כביסה לחלקים, ולהעביר אותם לתוך בארות חדשות המכילות 100 microliters של פתרון חסימה.
דגירה בטמפרטורת החדר לפחות 90 דקות, ומקסימום של ארבע שעות. לדלל את הנוגדנים העיקריים, אנטי PGP9.5 ואנטי 5G4, בפתרון העבודה. מעבירים את החלקים לתוך בארות חדשות המכילות 100 מיקרוליטרים של פתרון העבודה של הנוגדנים העיקריים, ו דגירה לילה בטמפרטורת החדר.
למחרת, לשטוף את החלקים בארות המכיל פתרון כביסה כפי שתואר קודם לכן. לדלל את הנוגדנים המשניים, עז אנטי ארנב כדי לזהות PGP9.5, ו עז נגד עכבר כדי לזהות 5G4, בתת פתרון העבודה. מעבירים את החלקים השטופים לתוך בארות חדשות המכילות 100 מיקרוליטרים של פתרון העבודה של הנוגדנים המשניים.
מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום כדי למנוע הלבנה של פלואורופור גדומה בנוגדנים משניים, ודורגים בטמפרטורת החדר במשך 90 דקות. לאחר מכן, לשטוף את החלקים פעמיים בתסת פתרון כביסה כפי שתואר קודם לכן. מעבירים את החלקים השטופים לתוך בארות חדשות המכילות 100 מיקרוליטרים של DAPI למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
לשטוף את החלקים פעמיים בתסת פתרון כביסה כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן, תקן את המקטעים בשקופית במיקום הנכון, תוך הימנעות מתיקיות שגויות. הוסף כמה טיפות של מדיום הרכבה לשקופית וכסה את המקטע עם פתק כיסוי.
תן לשקופיות להתייבש בן לילה. למחרת, לאחסן את השקופיות בתיבה מתאימה בארבע מעלות צלזיוס, הקפד להימנע מחשיפה לאור. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך או מיקרוסקופ קונפוקל, הצג את החלקים.
רכוש את התמונות באמצעות מצלמה המחוברת למיקרוסקופ. לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי או במיקרוסקופ קונפוקל כדי לנתח אותות חיוביים בחלקים במונחים של התפלגות מרחבית ועוצמת האות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. בעקבות השיטה המתוארת, אגרגטים אלפא סינוקליין שכותרתו עם נוגדן 5G4 מזוהים fascicles עצב עורי innervating מבנים אוטונומיים של חולי PD.
המורפולוגיה של מרבצי אלפא סינוקליין מופיעה כאות מנוקד לאורך האקסונים של עצבים עוריים. שימוש ייצוגי בפרוטוקול זה ב-19 חולי PD ו-17 פקדים בביופסיות עור בשלושה אתרים אנטומיים מראה כי ל-5G4 יש רגישות של 81% וספדיות של 86% בהשוואה לפקדים בריאים. Phosphorylated אלפא synuclein יש רגישות של 56%, ספציפיות של 100%5G4 ו זרחן אלפא סינוקלאין חיובי פיקדונות נמצאים בעיקר סביב בלוטות זיעה, אבל נמצאים גם פיילי שריר, כלי קטן, ופלקסוס subepidermal ו עורי, אבל אף פעם לא בסיבי עצב תוך ירך.
בדרך כלל, בתוך לומן בלוטות הזיעה, ניתן לצפות אות לא ספציפי שיכול להיות מתפרש לא נכון כמו 5G4 או זרחן אלפא סינוקליין חיובי. סוג זה של אות מנוקד, כדורי, והוא נובע ככל הנראה מחומר autofluorescent תוך-אלומיניום כפי שהוכח בפקדים טכניים ללא נוגדנים ראשוניים ומשניים. קולוקליזציה עם PGP9.5 שמסמן את סיבי העצב, אשר מורפולוגית הם filamentous ומוארך, מסייע לזהות את האות הנכון.
לכן, הספציפיות של אות 5G4 גדלה מאוד על ידי כשל חיסוני כפול עם סמן אקסונאלי. קיבעון מדויק של הביופסיה נחוץ לייצור כתם immunofluorescent באיכות טובה ולפרשנות אמינה של אותות פלואורסצנטיים. אם התיקון אינו מוכן כראוי, או אם התרחשה קיבעון יתר, התוצאה תהיה שפעת אוטומטית גבוהה שתסוו את האות של סיבי עצב החוצים את צומת העור-אפידרמיס, או פנימיים את המבנים העוריים העיקריים.
השלב הקריטי ביותר בהליך זה הוא קיבוע רקמות. שים לב ל- pH של פתרון תיקון PLP, ותזמון הדגירה, כדי למנוע שפעת אוטומטית ואות ספציפי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול לצביעה עקיפה באימונופלואורסצנציה בשיטת הציפה החופשית (free-floating) על חתכים של ביופסיות עור, במטרה לזהות וריאנטים של alpha synuclein המעורבים במחלת הפרקינסון. השיטה מאפשרת ניתוח של עצבים דרמליים ומספקת תובנות לגבי סמנים ביולוגיים פוטנציאליים לאבחון מוקדם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- פתולוגיה
- שיטות אבחון
רקע
- האבחנה של מחלת פרקינסון מסתמכת בעיקר על סימנים קליניים בשלבים מאוחרים.
- ביופסיות של העור מאפשרות ניתוח של רקמת עצב פריפרית המושפעת מהמחלה.
- זיהוי של צברי alpha synuclein עשוי לסייע באבחנה מוקדמת.
- הבנת התפשטות הצברים במערכת העצבים האנושית יכולה לחשוף היבטים של הפתוגנזה של המחלה.
מטרת המחקר
- ביסוס פרוטוקול חסון לזיהוי וריאנטים של alpha synuclein.
- הערכת ביופסיית עור ככלי אבחנתי לא פולשני.
- ניתוח ההפצה והמאפיינים של אגרגטים של alpha synuclein.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בדיקת אימונופלואורסצנציה עקיפה על חיתוכי ביופסיית עור.
- ניתוח של עצבים בעור כדי להעריך סמנים ספציפיים למחלה.
- הפרוטוקול כולל קיבוע דגימות, חיתוך וצביעה בנוגדנים.
- שימוש בנוגדנים ראשוניים ושניוניים המתמקד בווריאנטים ספציפיים.
- שלבים מרכזיים כוללים אינקובציה בטמפרטורות מבוקרות והליכי שטיפה קפדניים.
תוצאות עיקריות
- צבירי alpha synuclein זוהו בצרורות עצבים בעור של חולי פרקינסון.
- הנוגדן 5G4 הראה רגישות של 81% וסגוליות של 86% בהשוואה לקבוצות ביקורת בריאות.
- משקעי alpha synuclein מאושרפרים זוהו עם רגישות וסגוליות משתנות.
- קו-לוקליזציה תקינה עם PGP9.5 שיפרה את הסגוליות של אותים חיוביים.
מסקנות
- המחקר מדגים שיטה ישימה לזיהוי צברי alpha synuclein בביופסיות של העור.
- הממצאים מצביעים על פוטנציאל לשימוש בביופסיית עור כסמן ביולוגי אבחנתי לשלבים מוקדמים של מחלת הפרקינסון.
- תובנות לגבי פיזור הצברים יכולות לשפר את ההבנה של התקדמות המחלה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך ניהולי
גילוי מוקדם ופולשני באופן מינימלי של צברי alpha synuclein בסיבי עצבים בעור נותן מענה לפער קריטי בפיתוח סמנים ביולוגיים למחלת הפרקינסון. בדיקת אימונופלואורסצנציה זו מאפשרת הערכה כמותית הדירה של פתולוגיה חלבונית הרלוונטית למחלה ברקמה נגישה, ובכך תומכת במחקר תרגומי ובמיון תיקי פיתוח. שילוב פרוטוקול זה בתהליכי גילוי ומחקרים פרה-קליניים מגביר את הביטחון החזוי עבור תוכניות למחלות נוירודגנרטיביות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של פתולוגיה של alpha synuclein בעצבים פריפריאליים לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרה על ידי כימות צברי חלבונים הרלוונטיים למחלה ברקמה אנושית.
- מסייע למחקרים מונחי-היפותזה על התפלגות צברים והתקדמות המחלה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק תהליך עבודה סטנדרטי וניתן לשחזור של אימונופלואורסצנציה לצורך כימות חסון של סמנים ביולוגיים.
- מספק קריאות כמותיות של מיקום ועוצמת הצבירה לצורך ביצוע כיול (benchmarking) של הבדיקה.
- מאפשר ניתוח לרוחב דגימות וניתוח לרוחב זמן (longitudinal) לתמיכה במחקרי סריקה ותיקוף.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את זיהוי הביומארקרים הפריפריים לפתולוגיה הרלוונטית למחלה לצורך רציפות תרגומית.
- תומכת בניטור אורך של התפשטות אגרגטים בדגימות המופקות מחולה.
- מספקת בסיס להחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי קישור פתולוגיה מולקולרית לנקודות סיום קליניות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
בדיקת אימונופלורסצנציה זו מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים, תיקוף המטרה ומחקר תרגומי, על ידי מתן אפשרות לזיהוי כמותי של צברים של alpha synuclein בביופסיות של העור.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערת האפס ובבירור המכניסטי של אגרגציה של חלבונים בניוון עצבי.
- סריקה: מספק תוצרי בדיקה מהימנים וניתנים לשחזור לזיהוי וכימות של אגרגטים.
- אנליטיקה: מייצר נתוני מרחב ועצמה להשוואה סטטיסטית בין קהל חולים ונקודות זמן שונות.
- מחקר תרגומי: מאפשר רציפות מהשלב הפרה-קליני לשלב הקליני באמצעות דגימה חוזרת ופולשנית באופן מינימלי.
- שימוש חוזר ארגוני: התניידות של הפרוטוקול מאפשרת התמקדות בחלבונים נוספים או במודלים של מחלות בעצבים פריפריים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקר של מחלות ניווניות של מערכת העצבים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של עיבוד דגימות וניתוח אימונופלואורסצנציה לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות "המשך/עצור" (go/no-go) והקצאת הון על ידי אספקת נתוני ביומרקרים כמותיים מוקדמים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעוד סדרי עדיפויות מותאם סיכון של נכסים למחלות ניווניות של מערכת העצבים על בסיס פתולוגיה שעברה תיקוף.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באימונופלואורסצנציה, מיקרוסקופיה וניתוח תמונות כמותי.
- דורש קיבוע, חיתוך וטיפול בנוגדנים בדיוק רב כדי להבטיח ספציפיות של האות ולמזער אוטופלואורסצנציה.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים לצורך הדירות (reproducibility) בין אתרים שונים ובמדידות לאורכיות.
- ניתן להתאימו למטרות חלבון אחרות באמצעות פאנלים של נוגדנים ובקרות מאומתים.
- מגבלות פוטנציאליות כוללות אוטופלואורסצנציה של רקמות ואות לא ספציפי, הדורשים בקרות טכניות קפדניות.
