היתוך גנים אונגניים באמצעות שרשרת מעוגנת התגובה השרשרת מעוגן ואחריו רצף הדור הבא

פרוטוקול זה משמש לגילוי היתוך גנים אינפורמטיביים קריטיים לדגימות גידול של מטופלים. מצב ההיתוך של עשרות גנים מוערך בו זמנית בהסטה אחת. היתרון של טכניקה זו הוא שאני יכול לזהות היתוך גנים ללא קשר לזהותו של שותף ההיתוך מדגימות הגידול שעובדו על ידי קיבעון נוסחתי.

הגילוי של היתוך גנים מסוימים בדגימה גידול קליני מודיע ישירות אבחון, פרוגנוזה ובחירת טיפול בסוגים רבים של סרטן. זה קריטי להבין כי היתוך רבים שנקרא על ידי אלגוריתם הניתוח הם חפצים. המשימה הקשה ביותר בעת ניתוח נתונים היא הבחנה בין חפץ לבין שיחות היתוך אמיתיות.

התחל על ידי דילול חומצת גרעין הכוללת כדי להשיג את הריכוז הרצוי של RNA. עבור כל מדגם, להעביר 20 microliters של הדילול לתוך צינורות רצועת reagent priming אקראי בבלוק אלומיניום מקורר מראש ומערבבים על ידי צינור למעלה ולמטה שש עד שמונה פעמים. בקצרה לסובב את הדגימות, להעביר את כל עוצמת הקול לצלחת PCR 96-well, ולאטום עם סרט איטום צלחת.

הכנס את הצלחת לתוך התרמוצ'ילר, לכסות עם כרית הדחיסה, ולסגור את המכסה. דגירה ב 65 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר הדגירה, להעביר את כל הנפח של המוצר priming אקראי צינורות רצועת הרצועה הריג'נט הגדיל הראשון.

מערבבים על ידי צינור למעלה ולמטה ולסובב בקצרה למטה. העבר את עוצמת הקול כולה לצלחת PCR 96 היטב וחותם עם סרט RT. הכנס את הלוחית לתרמוציקלר והפעל את התגובה בהתאם לכיווני כתב היד.

בצע סינתזת cDNA גדיל השני, ותיקון, שלב קשירה אחד על פי הוראות כתב היד ולהמשיך לשלב הקשירה השני. כדי למספר את ברקוד מולקולרי או צינורות רצועת מתאם MBC, למקם את הצינורות אופקית עם צירים לחלק האחורי ולהשתמש סמן קבוע. קח את צלחת טיהור חרוזים מן הצעד הראשון קשירה ולהעביר 40 microliters של כל מדגם לתוך צינורות רצועת מתאם MBC, דואג לא להפריע גלולת חרוזים.

מערבבים את הריג'ים על ידי צינורות, לסובב את הצינורות, ולהעביר את כל הנפח לשלב הקשה שני צינורות רצועה reagent. מערבבים את הדגימות, מסובבים אותן כלפי מטה, ומ מניחים בבלוק תרמוסיקלר. השאירו את המכסה המחומם והפעילו את התרמוצ'ילר ב-22 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, ואחריו 4 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, להכין את חרוזי ניקוי קשירה על ידי מערבולת אותם והוספת 50 microliters לקבוצה חדשה של צינורות פס PCR. דגירה על המגנט לדקה אחת ולהשליך את העל-טבעי. הסר את צינורות הרצועה מהמגנט ולחץ מחדש על חרוזים ב 50 microliters של חיץ ניקוי קשירה על ידי צינור למעלה ולמטה.

העבר את אמצעי האחסון לדוגמה כולו מהשלב השני של הרצועה לתוך רצועת חרוז ניקוי הרצועה. Vortex הדגימות לערבב ולהשאיר אותם בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. וורטקס הדגימה פעם אחת באמצע הדגירה.

לאחר מכן, מערבולת הדגימות, לסובב אותם למטה, דגירה על המגנט לדקה אחת. השלך את העל-טבעי והוסף 200 מיקרוליטרים של מאגר ניקוי קשירה טרי. מערבולת כדי להתרכך, להסתובב למטה, ולמקם על המגנט לדקה אחת.

לאחר שתי שטיפה, לבצע שטיפה שלישית באמצעות מים אולטרה חוץ במקום חיץ. תן שימוש חוזר את חרוזים ב 20 microliters של 5 מילימטרים נתרן הידרוקסיד ולהעביר את הדגימות לצלחת PCR 96-well. מניחים את הצלחת לתוך תרמוצ'ילר עם כרית דחיסה ולהפעיל אותו ב 75 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, ואחריו להחזיק 4 מעלות צלזיוס.

לאחר הדגימות התקררו ל 4 מעלות צלזיוס, מניחים את הצלחת על מגנט לפחות שלוש דקות ולהמשיך עם PCR הראשון. הכן את תגובות PCR על ידי הוספת שני מיקרוליטרים של פריימרים GSP1 לכל באר של רצועת הריג'נט PCR הראשונה. העבר 18 מיקרוליטרים של מוצר ניקוי הרצועות השני לצינורות רצועת הריג'נט הראשונים של PCR ומערבבים על ידי צינורות למעלה ולמטה.

סובב את הדגימות והעבר אותן לצלחת PCR של 96 באר. מניחים אותם לתוך התרמוצ'ילר ולהפעיל PCR על פי הוראות כתב היד. המשך עם טיהור חרוזים על ידי הוספת 20 microliters של המוצר PCR לצלחת U-bottom מלא 24 microliters של חרוזים טיהור לבא.

פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב ולהשאיר את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות, ואז להידגר את הצלחת על המגנט במשך שתי דקות. השליכו את העל-טבעי מהחרוזים ושטפו אותם פעמיים עם 200 מיקרוליטרים של 70% אתנול. לאחר הכביסה הסופית, להסיר את כל האתנול ולתת את האוויר לדגום יבש במשך שתי דקות.

מוציאים את הלוחית מהמגנט ומוציאים מחדש את חרוזים ב-24 מיקרוליטרים של טריס-HCl 10 מילימטר ו-pH 8.0. דגירה את המגנט במשך שלוש דקות ולאחר מכן למקם את הצלחת בחזרה על המגנט במשך שתי דקות. התחל כימות ספרייה על ידי הכנת אחד עד חמישה דילולים של מוצר PCR השני ב 10 מילימטר טריס-HCl.

בצע זאת על-ידי דילול סדרתי של 1:199, 1:199 ו- 20:80 ב- 10 מילימטר טריס-HCl עם 05%polysorbate. הגדר PCR מפתח על ידי הוספת שישה microliters של תערובת אב לכל באר של צלחת אופטית 96 באר, ואחריו ארבעה microliters של דילול או תקן המתאים. לסובב את הצלחת טען אותו לתוך מכשיר qPCR.

בצע qPCR בהתאם לכיווני כתב היד. לאחר כימות הספרייה הושלמה, לדלל את כל הספריות לשני nanomolar עם 10 מילימטר טריס-HCl. הפוך בריכת ספרייה על ידי שילוב של 10 microliters של כל ספרייה מנורמלת לתוך צינור אחד 1.5 מיליליטר מיקרוצנטריפוגה.

לאחר מכן, הכינו את ספריית האמפליקון, או בריכת DAL, על ידי שילוב של 10 מיקרוליטרים של בריכת הספרייה עם 10 מיקרוליטרים של 0.2 נתרן הידרוקסידי רגיל ודגירה של התערובת במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, להוסיף 10 microliters של 200 מילימטר טריס-HCl ב pH 7.0, ואחריו 970 microliters של חיץ הכלאה HT1. הפוך את צינור העומס הסופי על ידי שילוב של 300 microliters של HT1, 25 microliters של 20 picomolar PhiX, ו 675 microliters של בריכת DAL.

הוסף את כל עוצמת הקול של צינור העומס ל הבאר לדוגמה של מחסנית הריג'נט הרצף וטען את המחסנית לרצף. התחל על-ידי בחירת דוגמת הבקרה החיובית וודא שכל ההיתוך הצפוי והאיסופורמים האונקוגניים זוהו והם מפורטים בכרטיסיה ראיות חזקות. עבור כל דוגמה, בדוק את אתרי ההתחלה הייחודיים הממוצעים לכל ערך פקד GSP2 ולאחר מכן דמיין את קריאות התמיכה עבור כל היתוך פוטנציאלי על-ידי לחיצה על הקישור הצג חזותי שלוקח את המשתמש לתצוגת JBrowse מבוססת אינטרנט של ערימות של קריאות תומכות היתוך בודדות.

ודא כי קריאות הם בעיקר ללא התאמה, אבל יותר מ 30 בסיסים של קריאות ליישר עם שותף היתוך, כי רצפים הסמוכים נקודת העצירה בין הגנים ואתרי איגוד פריימר הם ללא הוספות או מחיקות. זה קריטי כדי להבטיח כי כל היתוך שיחה הוא בדרך כלל ללא אי התאמה, כי חלק משמעותי של הקריאות ליישר את השותף היתוך. פרוטוקול זה שימש כדי לחקור את מצב היתוך גנים בדגימה אדנוקרצינומה ריאות.

הסיכום מציג היתוך ראיות חזק והדף 'קריאת סטטיסטיקה' מציג מדדים של המדגם. מדגם זה מציג איכות RNA טובה כך תוצאות שליליות ידווחו אם לא נמצאו היתוך. לשיחת היתוך לגיטימית יש מספר גבוה של קריאות תומכות, אחוז גבוה של קריאות מה פריימר התומך בהיתוך ומספר גבוה של אתרי התחלה.

הדמיה של קריאות מדגימה יישור טוב לאזורים גדולים של שותף ההיתוך. לעומת זאת, לשיחת היתוך חפצים יש מדדי תמיכה נמוכים יותר וקצב שגיאות גבוה בעת מיפוי לשותף. שיחות היתוך חפץ שבוצעו על ידי אלגוריתם הניתוח נפוצות.

זה קריטי כדי לבדוק באופן ידני כל שיחה כדי להבטיח שהוא מייצג היתוך גנים אמיתי בדגימה החולה.