שימוש בעלי כניסה ויראלי וניתוח עגינה מולקולרית לזיהוי מועמדים אנטי-ויראליים A16

פרוטוקול זה יכול לסייע בגילוי מולקולות קטנות אנטי ויראליות פוטנציאליות באמצעות גישה מונעת מנגנון. זמן ההתוספת קובע באיזה שלב של הזיהום המולקולה הקטנה מציגה את הפעילות האנטי ויראלית שלה. עגינה מולקולרית מנבאת את האינטראקציה בין המולקולה הקטנה לחלבונים הנגיפיים.

כדי להעריך את ההשפעה של תרופות על תאים מארחים לפני זיהום ויראלי, זרע תאי RD ב 12-well צלחות ב פעמיים 10 לתאים החמישי לכל צפיפות ציפוי היטב. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני אינקובטור לילה. למחרת בבוקר, לטפל בכל באר של monolayer מו"פ עם תרכובת בדיקה של עניין, ב triplicate, בריכוזים רעילים במיליליטר אחד של מדיום בסיס במשך שעה או ארבע שעות.

בסוף הדגירה הטיפולית, לשטוף את התאים עם מיליליטר אחד של PBS לפני הוספת 50 פלאק להרכיב יחידות של וירוס ב 300 microliters של מדיום בסיס ל הבאר במשך שעה אחת, עם נדנדה כל 15 דקות. בסוף דגירה זיהום, לשטוף את התאים עם PBS ול כיסוי התאים עם מיליליטר אחד של מדיום בסיס טרי המכיל 0.8% methylcellulose. לאחר 72 שעות באינקובטור תרבות התא, לשטוף כל באר עם שני מיליליטר של PBS ולתקן את התאים עם 0.5 מיליליטר של 37% פורמלדהיד ל הבאר במשך 15 דקות.

בסוף קיבעון, לשטוף את בארות עם PBS ולהכתים את התאים עם 0.5 מיליליטר של 0.5% פתרון סגול גביש לגם. לאחר שתי דקות, לשטוף את בארות עם זרם עדין של מים ולאפשר את הצלחת לאוויר יבש. לאחר מכן מניחים את הצלחת על תיבת אור לבן לספירה ומחשבים את אחוז התאים הנגועים coxsackievirus על פי הנוסחה.

לניתוח עגינה מולקולרית, הורד מולקולות תלת-מימד של תרכובות הבדיקה מ- PubChem. אם למולקולה אין מבנה תלת-מימדי מועלה, הורד את המבנה הדו-מימדי או השתמש ברצף המיתרים SMILE כדי להפוך את המבנה למולקולה תלת-מימדית באמצעות תוכנית מולקולרית מתאימה. לאחר מכן, הורד יחידת הרכבה ביולוגית ויראלית מבנק נתוני החלבון RCSB.

באמצעות תוכנית ביו-מחשוב מתאימה, למחוק את הממסים מקובץ בנק הנתונים חלבון, להחליף את שרשראות הצד שלם באמצעות נתונים מספריית Dunbrack 2010 rotamer ולהוסיף מימן ומטענים למבנה כפי שדווח בעבר. כדי לעגן את תרכובות הבדיקה על יחידת הווירוס מוכן, להעלות את קובץ תרכובת הבדיקה לתוך אוניברסיטת קליפורניה סן פרנסיסקו כימרה כמו ligand ולבחור את החלבון ויראלי מוכן כולו כמו הקולטן לבצע עגינה עיוורת. לעגינה נוספת, הגבבלו את אתר העגינה לחלבון הוויראלי לאזורים מעניינים הנגזרים מתוצאות העגינה העיוורת על ידי צמצום נוסף של נפח החיפוש.

לאחר מכן העלה את קובץ העגינה למערכת גרפיקה מולקולרית מתאימה כדי לנתח את מיקומי מצב האיגוד. בחרו את הליגנד כדי למצוא מגעים קוטביים מהתרכובת לחלבון הנגיפי, וזיהו את המגעים הקוטביים עם האפשרות אטומים כלשהם. שתי המולקולות הקטנות שנבדקו בניסוי מייצג זה, יצרו רק השפעה שולית על ההדבקה של coxsackievirus A16, בין אם בטיפול מקדים בתאים המארחים לפני זיהום ויראלי או בטיפול שלאחר ההדבקה.

לעומת זאת, המולקולות זלזלו ביעילות בזיהום ביותר מ-80% בטיפול התוספת השותף, מה שמרמז על כך ששני התרכובות הן היעילות ביותר כאשר הן נמצאות בו זמנית עם חלקיקי הנגיף על פני התא המארח במהלך ההדבקה. ניתוח מחייב מבוסס ציטומטריית זרימה מאשר כי שני הטאנינים מנעו כניסת זיהומיות A16 coxsackievirus על ידי מניעת איגוד חלקיקים ויראלי לתאים המארחים. עגינה מולקולרית של הטאנינים מצביעה על כך ששניהם צפויים להיקשר באזור הקניון של פנטמר coxsackievirus, ממש מעל הכניסה לכיס המחזיקה את גורם הכיס וממלאת תפקיד חשוב לתיווך כריכת coxsackievirus וכניסה לתא המארח.

בתחזיות פני השטח הללו ניתן לראות את השאריות הייחודיות החזויות ממגעי הקוטב של המולקולות הקטנות סביב הכניסה לכיס, עם אספרג'ין-85, ליסין-257 ואספרג'ין-417 במשותף בין שני הטאנינים. עבור עגינה מולקולרית, הטופולוגיה של החלבון הנגיפי צריכה להילקח בחשבון בעת דירוג מסגרות הכריכה. ניסויים נוספים יכולים לכלול בדיקת הפעילות האנטי ויראלית של המתחם על וירוסים רקומביננטיים, עם מוטציות על חומצות האמינו שהתגלו כדי לאמת את חשיבותם ליעילות התרופה.